白牡丹，郝國偉，張曉偉，楊 盛，郭黃萍

(山西省農業(yè)科學院 果樹研究所/果樹種質創(chuàng)制與利用山西省重點實驗室，太原 030031)

山西省是中國梨的主要產區(qū)之一，栽培范圍廣，在栽培過程中已演化出豐富的梨種質資源，如‘金梨’‘黃梨’‘小白梨’和‘油梨’等品質優(yōu)良的地方品種。了解這些地方梨品種的群體結構和親緣關系，對山西省梨資源的搜集、保護及利用都具有重要的指導意義。

目前，DNA分子標記技術已廣泛應用于物種進化分類、基因組研究、遺傳學和分子分類學等許多研究領域[1-4]。其中，以SNP為代表的第三代分子標記技術，在分子遺傳圖譜構建、遺傳多樣性與種質鑒定、重要性狀相關基因的定位和分子標記輔助選擇等農作物育種領域發(fā)揮著重要作用[5-7]。SLAF-seq(specific-locus amplified fragment sequencing)是特異性位點擴增片段測序技術的簡稱，該技術降低了基因組的復雜度，并且不依賴基因組序列，成為SNP標記開發(fā)的首選。相對于傳統(tǒng)的技術，SLAF-seq技術不僅節(jié)省測序成本和時間，而且在有參考基因組生物和無參考基因組生物中都可以廣泛應用[8-9]。

本研究擬通過簡化基因組技術SLAF-seq，對山西省30份地方梨品種資源進行高通量測序，鑒定SNP，并利用獲得的SNP數據進行群體多樣性分析，包括進化樹分析、群體結構分析及群體特異SNP標記的開發(fā)。這將為山西省地方梨種質資源的科學利用、品種選育、果樹生產及分子標記輔助育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以山西省農業(yè)科學院果樹研究所梨資源圃搜集到的山西省各地區(qū)的30份地方梨品種為試材(表 1)。

1.2 基因組DNA 制備

2018年4月下旬，采集幼嫩的梨葉片做標記置于液氮中帶回室內，放至超低溫冰箱中，備用。采用CTAB法提取基因組 DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳和ND-1000分光光度計檢測基因組 DNA的質量及濃度。按照高通量測序的要求，每樣品的DNA濃度達到30 ng·L-1，樣品純度OD260/280分布在1.8～2.0之間，電泳結果主帶清晰，無 降解。

1.3 酶切方案的設計和Illumina HiSeq測序

選取梨(Pyrus)基因組作為參考基因組進行酶切預測，梨基因組大小約為512 Mb，GC含量為37.29%(http://peargenome.njau.edu.cn/default.asp?d=4&m=2)。利用SLAF酶切預測軟件對參考基因組進行酶切預測，選擇最適的酶切方案。同時，選用日本晴水稻作為對照進行評估酶切方案的準確性。

根據選定的最適酶切方案，對檢測合格的各樣品基因組DNA分別進行酶切，對SLAF標簽(酶切片段長度為264～314 bp的序列)進行3′端加A處理、PCR擴增和切膠選取目的片段等過程，文庫質檢合格后用Illumina HiSeq XTen進行測序[10]。

1.4 群體遺傳分析

利用Dual-index對測序得到的原始數據進行識別，得到各個樣品的序列(reads)，過濾、接頭后對測序質量和數據量進行評估[11]。SLAF標簽的獲得和SNP標記的開發(fā)參照段義忠等[12]的方法。一般MAF>0.05的SNP在群體分析中被認為是有代表性的SNP。篩選出的有代表性的SNP通過Admixture[13]軟件分析群體結構，通過MEGA5[14]軟件結合neighbor-joining算法進行進化分析。

表1 山西省地方梨品種原始地理分布信息Table 1 Original geographic distribution of local pear germplasm in Shanxi

2 結果與分析

2.1 簡化基因組序列的產出和質量評估

對梨(Pyrus)參考基因組進行電子酶切預測，最終確定使用RsaⅠ+HaeⅢ酶切，預測到100 227個SLAF標簽，在基因組上基本分布均勻，酶切方案可行。試驗中，對照基因組(水稻)測序獲得0.22百萬序列(MReads)的數據量。從30個梨地方品種共獲得83.79 Mreads數據，測序平均Q30為96.33%，平均GC含量為38.90%(表2)。Q30數據表明測序質量高，測序結果 可靠。

表2 各樣品測序數據統(tǒng)計Table 2 Statistics for sequencing data

2.2 SNP 分子標記的鑒定

通過序列分析，從30個地方梨品種中共獲得603 177個 SLAF 標簽，并鑒定到多態(tài)SLAF標簽320 703個。通過分析多態(tài)SLAF標簽，鑒定到2 140 079 個 SNP標記，每個樣品的SNP數目從802 818至1 310 957不等，這些SNP的平均完整度為37.51%～61.26%。分析SNP 可以看到，不同樣品的 SNP 雜合率為10.98%～ 18.39%，它們之間存在一定差異，表明梨樣品基因組的雜合度很高(表3)。

2.3 群體遺傳分析

基于篩選出的有效 SNP，采用 Admixture 軟件計算了30個山西省地方梨品種的群體結構。從圖 1 可見，當K為 2 時，交叉驗證錯誤率最低，擁有最低交叉驗證錯誤率的分群數為最優(yōu)分群數，所以，30個梨品種大致可以分為兩大類?！“桌妗t肖梨’‘海桃’‘碩豐梨’‘金梨’‘馬蹄黃’‘碭山黃’‘佛見喜’‘水紅肖’‘鐵梨’‘金梨變’‘笨梨’‘晉蜜梨’‘玉酥梨’‘晉早酥’‘玉露香梨’和‘甘子梨’來自于第一個原始祖先的可能性較大；‘香水梨’‘油梨’‘原平紅’‘肖梨’‘車頭梨’‘錘梨’‘晉酥梨’‘隰縣甜梨’‘酸圪盧’‘晉城夏’‘大黃梨’‘白肖梨’和‘兔頭紅’來自于第二個原始祖先的可能性較大。

表3 SNP統(tǒng)計Table 3 Statistics of identified SNPs

利用SNP標記信息，對30份地方梨品種進行聚類分析(圖 2)，在相似系數0.911處，所有梨種質聚為4個組。第一組包括3份種質，分別為‘小白梨’‘紅肖梨’和‘海桃’，前者為白梨，后兩者為秋子梨。第二組有1份種質‘碩豐梨’，原產地山西太谷。第三組包括12份種質，在相似系數0.946處，可以劃分為3個亞組，第1亞組包括1份種質‘金梨’；第2亞組包括‘馬蹄黃’和‘碭山黃’2份種質，起源地不確定；第3亞組包括9份種質，每個品種都有不同的分支，原產地各不同。第4組包括14份種質，在相似系數0.95處，可以劃分為2個亞組，第1亞組包括3份種質，‘晉蜜梨’‘玉酥梨’和‘晉早酥’的原產地在山西太谷；第2亞組包括11份種質，其中‘玉露香梨’ ‘晉酥梨’的原產地為山西太谷，‘車頭梨’‘錘梨’和‘甘子梨’的原產地為山西永濟，其他均在山西高平和晉城。另外，‘馬蹄黃’與‘碭山黃’在田間性狀上比較相似，在進化樹上顯示兩者親緣關系較近，推斷二者可能屬于同種不同名；‘金梨’與‘大黃梨’在田間性狀上比較相似，在進化樹上顯示兩者親緣關系較遠，可以斷定二者為不同梨品種。

圖1 K值對應的交叉驗證錯誤率Fig.1 Admixture validation error rate corresponding to K value

圖2 梨品種的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of pear varieties

3 討 論

3.1 簡化基因組技術在果樹分子標記開發(fā)上的可行性及優(yōu)勢

目前，主要的簡化基因組測序技術有，基于限制性核酸內切酶的測序技術(RAD-seq)、基因分型測序技術(GBS)、基于IIB 型限制性核酸內切酶的測序技術(2b-RAD)和特異性長度擴增片段測序技術(SLAF-seq)[15-18]。這些技術只對酶切片段進行測序，可大幅降低基因組的復雜度，不受參考基因組的限制，操作簡便，可進行大規(guī)模SNP標記的開發(fā)和分析。本試驗運用 SLAF-seq 技術，在山西省30份地方梨品種中共獲得83.79 MReads，開發(fā)了603 177個SLAF 標簽，其中多態(tài)性 SLAF 標簽320 703個，從中鑒定到 2 140 079個SNP，利用有效的SNP標記分析了相應梨品種的群體結構和系統(tǒng)發(fā)生樹，為山西省地方梨品種的親緣關系提供依據。

3.2 山西省地方梨種質資源聚類及親緣關系 分析

遺傳多樣性評價對種質資源的保護和有效利用具有重要意義。在梨屬種質資源研究中，曲柏宏等[19]利用RAPD技術把40個梨品種和類型劃分為7類。趙國芳[20]利用ISSR分子標記技術對四大栽培系統(tǒng)具有典型代表性的25個栽培梨品種進行聚類,得出白梨系統(tǒng)與秋子梨系統(tǒng)親緣關系較近,其次與砂梨系統(tǒng)親緣關系較近，與西洋梨系統(tǒng)親緣關系較遠。岳曉燕等[21]選用17對SSR引物對福建的49個梨樣品的遺傳多樣性進行分析，基于Nei和Li的遺傳距離的鄰接法將所有地方品種劃分為9個組。Song等[22]利用134個SSR標記將99個梨品種的遺傳結構進行分析，結果表明日本梨與中國梨親緣關系密切。張小雙[23]將244份中國北方地方梨品種和野生資源聚類為4組，且聚類分析結果與地理位置相關。本試驗利用SNP標記把30份山西地方梨品種聚類為4大組，聚類分析結果與地理位置沒有明顯的關系，與Cao等[24]的研究結果不同。大多數地方梨品種聚到第4組，說明山西地區(qū)的梨種質親緣關系較近，地方梨品種的更進一步歸類應該結合果實性狀進一步研究。

3.3 山西省地方梨種質資源的鑒定與利用

山西省地方梨種質資源的遺傳多樣性豐富，在品種改良和選育的過程中，保證品種的真實性和純度不容忽視。生產上，一般采用形態(tài)性狀進行梨品種鑒定，鑒定周期長、準確性較低。梨為多年生木本植物，童期長，很多品種在苗期的形態(tài)差異較小，利用傳統(tǒng)的形態(tài)性狀等方法難以區(qū)分各個品種[25]。在本研究中，利用SNP標記可以快速客觀地鑒定出在田間性狀比較相似的品種，如‘金梨’與‘大黃梨’為不同梨品種，‘馬蹄黃’和‘碭山黃’可能屬于同種不同名，但仍需進一步試驗驗證。今后也可以利用親緣關系較遠的品種進行配置雜交組合。