張銀霞 ，沈文娟 ，韓雪琴，張振海，田 蕾 ，楊淑琴 ，羅成科，李培富(.寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，銀川 7500； .寧夏回族自治區(qū)原種場(chǎng)，銀川 75000；

3.寧夏農(nóng)林科學(xué)院 農(nóng)作物研究所，寧夏永寧 750105)

水稻(Oryzasativa)是重要的糧食作物，而被稱為“水稻癌癥”的稻瘟病會(huì)使水稻大幅度減產(chǎn)甚至絕收，是全球糧食安全的重大隱患。據(jù)全國(guó)農(nóng)作物重大病蟲(chóng)害預(yù)警，2018年稻瘟病在中國(guó)的發(fā)病面積為7500萬(wàn)畝次，較2017年偏重流行[1]。在寧夏地區(qū)稻瘟病是常發(fā)性病害，也是重要的病害之一，嚴(yán)重威脅著水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)。對(duì)水稻新品種的培育來(lái)說(shuō)，抗病基因的利用是抗病育種的基礎(chǔ)和核心。抗性基因可操作性強(qiáng)、效果明顯，因此，人們?cè)诤茉缫郧熬烷_(kāi)始開(kāi)展主要抗性基因的鑒定及其應(yīng)用研究。Piz和Pik是水稻中目前報(bào)道含有廣譜高抗稻瘟病最多的2個(gè)位點(diǎn)，它們分別包含Pi2、Pi9、Pizt和Pi1、Pikh、Pikm復(fù)等位基因[2-4]。Pita和Pib在中國(guó)很多稻區(qū)也表現(xiàn)出很高水平的抗性[5-6]，但這些位點(diǎn)或基因在國(guó)內(nèi)品種資源中的分布及利用還缺乏完善的研究，限制了它們?cè)谟N中的應(yīng)用。針對(duì)寧夏地區(qū)近幾年選育的水稻新品種對(duì)稻瘟病抗性較低或僅能達(dá)到中抗，而全國(guó)各地都已實(shí)施新品種審定稻瘟病“一票否決制”，所以本研究擬采用已克隆抗稻瘟病基因的功能標(biāo)記對(duì)寧夏水稻種質(zhì)資源進(jìn)行分子掃描，結(jié)合稻瘟病抗性的人工接種鑒定和自然誘發(fā)鑒定，進(jìn)而開(kāi)展稻瘟病抗性與抗性基因的關(guān)聯(lián)分析，確定寧夏水稻抗稻瘟病的主要基因，揭示寧夏水稻抗稻瘟病的遺傳基礎(chǔ)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)主要抗病基因在寧夏水稻品種中的應(yīng)用進(jìn)行評(píng)價(jià)，以期為抗病品種的應(yīng)用及抗病基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試水稻材料 以143份寧夏水稻種質(zhì)資源(98份寧夏自育水稻品種和45份雜交后代)作為試驗(yàn)材料。

1.1.2 供試稻瘟病菌菌株 供試稻瘟病菌菌株由寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院植保實(shí)驗(yàn)室李文強(qiáng)老師提供，是從寧夏各水稻種植區(qū)收集到的致病性強(qiáng)且致病力頻率高的稻瘟病菌經(jīng)過(guò)單胞分離純化后的菌株，如表1所示。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 寧夏水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性的鑒定水稻材料在寧夏大學(xué)水稻育種基地種植，每個(gè)材料種植2行，每行10株，株距10 cm，行距26 cm，每隔2行種植1行誘發(fā)行(楊和白皮稻)。在水稻分蘗期采用人工接種和自然誘發(fā)相結(jié)合的方法進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。在分蘗初期和盛期調(diào)查3次葉瘟，在抽穗期及黃熟期調(diào)查2次穗瘟。葉瘟的調(diào)查在每個(gè)小區(qū)以發(fā)病最重的2～3株的平均發(fā)病等級(jí)作為該品種的抗性級(jí)別，穗瘟的調(diào)查在每個(gè)小區(qū)隨機(jī)抽查10株，記錄發(fā)病率和病級(jí)。稻瘟病發(fā)病情況按照國(guó)際水稻所(IRRI)稻瘟病抗性評(píng)價(jià)葉瘟分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)?？剐栽u(píng)價(jià)值越大，越容易感病。具體分級(jí)見(jiàn)水稻品種試驗(yàn)稻瘟病抗性鑒定與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)程中的水稻稻瘟病抗性綜合評(píng)價(jià)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)[7](高抗<0.1，抗0.1～2.0，中抗4.1～6.0，感6.1～7.5，高感7.5～9.0)。

表1 供試稻瘟病菌菌株Table 1 Rice blast strains in this study

1.2.2 寧夏水稻種質(zhì)資源抗稻瘟病基因的分子掃描 引物合成：PCR特異性引物由生工生物工程(上海)股份有限公司北京分公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2 稻瘟病抗性基因引物序列Table 2 Gene primer sequence of rice blast resistance

寧夏水稻種質(zhì)資源基因組DNA的提取及擴(kuò)增：采用改良SDS法提取水稻基因組DNA，并用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量和濃度[8]。然后以DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，包含PCR緩沖液10×Buffer(25 mmol/L、含Mg2+)2.0 μL， dNTP(2.5 mol/mL)0.4 μL，引物( 4 pmol/L) 2.0 μL，TaqDNA 聚合酶(5 U /μL) 0.2 μL，模板DNA(約15 ng /L)2.0 μL，最后用ddH2O補(bǔ)足20 μL。

PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序：94 ℃，5 min；35個(gè)循環(huán)；94 ℃，45 s，退火溫度依據(jù)引物說(shuō)明而定， 72 ℃，1.5 min；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳分離，核酸染料染色，在紫外凝膠成像儀上觀察并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 寧夏水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性的鑒定

依照國(guó)際水稻所稻瘟病發(fā)病級(jí)別的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)寧夏水稻種質(zhì)資源進(jìn)行抗性鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)寧夏水稻種質(zhì)資源對(duì)本地區(qū)的稻瘟病以中抗和中感的材料居多。少數(shù)材料表現(xiàn)為感病和抗病。其鑒定結(jié)果如表3所示。

表3 寧夏水稻種質(zhì)資源稻瘟病抗性鑒定結(jié)果Table 3 Performance of rice blast resistance of rice germplasm resources in Ningxia

(續(xù)表3 Continued table 3)

2.2 寧夏水稻種質(zhì)資源抗稻瘟病基因的分子 檢測(cè)

利用已克隆的抗稻瘟病基因Pita、Pikh、Pib、Pi2、Pikm、Pi9、Pi5、Pid2的功能標(biāo)記對(duì)寧夏水稻種質(zhì)資源進(jìn)行分子掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在寧夏水稻種質(zhì)資源中均檢測(cè)到了抗稻瘟病基因，其數(shù)量從1個(gè)到6個(gè)不等。其中最多的有6個(gè)基因，分布在‘寧粳25號(hào)’‘寧粳28號(hào)’‘寧粳36號(hào)’‘花119’等。最少的是1個(gè)基因，分布在‘寧粳42號(hào)’‘大琥板稻’(表4)?；驍?shù)量相同的不同種質(zhì)的抗性存在差異，說(shuō)明稻瘟病抗性基因之間存在互作關(guān)系。部分PCR分子檢測(cè)結(jié)果如圖1和表4所示。

M.100 bp Ladder;1.寧粳3號(hào)；2.寧粳7號(hào)；3.寧粳9號(hào)；4.寧粳12號(hào)；5.寧粳14號(hào)；6.寧粳15號(hào)；7.寧粳16號(hào)；8.寧粳18號(hào)；9.寧粳19號(hào)；10.寧粳23號(hào)；11.寧粳24號(hào)；12.寧粳25號(hào)；13.寧粳26號(hào)；14.寧粳27號(hào)；15.寧粳28號(hào)；16.寧粳31號(hào)；17.寧粳32號(hào)；18.寧粳33號(hào)；19.寧粳34號(hào)；20.寧粳35號(hào)；21.寧粳36號(hào)；22.寧粳37號(hào)；23.寧粳38號(hào)；24.寧粳39號(hào)

2.3 寧夏水稻種質(zhì)資源主要抗稻瘟病基因的分析

通過(guò)對(duì)抗稻瘟病基因在寧夏水稻種質(zhì)資源中的抗性分布分析，發(fā)現(xiàn)含有Pid2基因的供試材料有90.91%的抗性達(dá)到中抗且沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感病材料，顯著的高于其他基因組合的供試材料。含有Pita、Pikm、Pi9、Pi5、Pi2基因的供試材料分別有1.19%、0.91%、1.69%、1.35%、1.54%的抗性能夠達(dá)到抗稻瘟病，其中含有Pikm基因的材料中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感病材料，中感的比例也比較低，含有Pi9、Pi5、Pi2基因的供試材料沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感病材料(圖2)。所以在抗稻瘟病分子標(biāo)記輔助選擇育種中Pikm、Pi9、Pi5、Pi2和Pid2是首選基因，可以作為寧夏水稻抗病性育種的優(yōu)勢(shì)基因。而含有Pita和Pib基因的材料發(fā)現(xiàn)感病材料，中感的材料比例也比較高，所以在抗病性品種選育中不可取。

2.4 主要抗稻瘟病基因在寧夏水稻種質(zhì)資源中的分析

由圖3可以看出，在寧夏水稻育種中表現(xiàn)優(yōu)勢(shì)的抗稻瘟病基因Pikm、Pi9、Pi5、和Pid2在寧夏水稻種質(zhì)資源中的分布頻率分別是0.56、 0.35、0.30和0.11，占的比例相對(duì)比較低。可見(jiàn)，在抗稻瘟病育種中應(yīng)注意充分利用抗稻瘟病基因尤其是Pikm、Pid2和Pi9位點(diǎn)的相關(guān)基因。

表4 抗稻瘟病基因的分子檢測(cè)結(jié)果Table 4 Molecular marker-assisted detection of blast resistance genes

(續(xù)表4 Continued table 4)

(續(xù)表4 Continued table 4)

(續(xù)表4 Continued table 4)

圖2 抗稻瘟病基因在供試材料中的抗性分布Fig.2 Distribution of resistance gene to rice blast in tested materials

3 討 論

目前水稻抗稻瘟病分子育種盡管取得了顯著的成效，但是不同抗稻瘟病基因?qū)μ镩g哪些稻瘟病致病性菌株起作用難以預(yù)測(cè)，導(dǎo)致育種家在選育過(guò)程中難以選出相應(yīng)的抗性基因[9]。如果明確了某一特定區(qū)域內(nèi)多個(gè)抗稻瘟病基因的抗性和水稻品種中含有的抗稻瘟病基因類型，那么開(kāi)展水稻抗稻瘟病新品種選育和品種抗性布局工作就有基礎(chǔ)和理論指導(dǎo)。在水稻稻瘟病抗性基因評(píng)價(jià)方面，已陸續(xù)報(bào)道的抗性基因有84個(gè)[10]。李進(jìn)斌等[11]分析了22個(gè)抗瘟基因在云南省3個(gè)稻區(qū)的抗性，確定了Pi9和Piz5的高抗地位；劉文德等[12]分析了24個(gè)抗瘟基因在福建省的抗性，Pikh抗性最強(qiáng)，抗譜達(dá)98.15%，Pi-1和Pi-9抗譜也較高，是優(yōu)質(zhì)抗源。寧夏水稻種質(zhì)資源經(jīng)抗稻瘟病基因的功能標(biāo)記分子檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攜帶抗稻瘟病基因數(shù)可以達(dá)到6個(gè)[13]，但起主要作用的抗瘟基因尚不清楚。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)在寧夏這個(gè)特殊氣候和地理環(huán)境條件下，Pikm、Pi9、Pi5、和Pid2抗稻瘟病基因發(fā)揮著主要的作用，尤其Pikm抗性基因在供試材料中占了56%，能達(dá)到中抗的材料80.91%，充分說(shuō)明了此基因的主要作用。何琳等[14]、薛清芝等[15]利用SSR分子標(biāo)記分別對(duì)抗稻瘟病基因Pi-1和Pi-15(t)進(jìn)行檢測(cè)，明確了部分水稻品種攜帶此基因的情況；時(shí)克等[16]利用Pi-ta和Pi-b抗稻瘟病基因序列內(nèi)的功能標(biāo)記對(duì)58份水稻品種進(jìn)行了檢測(cè)，明確了其在當(dāng)?shù)氐姆植记闆r。本研究在確定了寧夏地區(qū)主要抗稻瘟病基因的基礎(chǔ)上，對(duì)其在寧夏水稻種質(zhì)資源中的分布做了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)發(fā)揮主要作用的抗性基因分布頻率比較低，尤其Pid2抗稻瘟病基因僅占11%。但此抗性基因的抗性可達(dá)到90.91%。因此，為了加速抗稻瘟病基因的分子標(biāo)記輔助選擇育種，發(fā)掘和鑒定廣譜持久抗稻瘟病基因，將其安全滲入或聚合到綜合性狀優(yōu)良的水稻材料中是重要的基礎(chǔ)。

圖3 抗稻瘟病基因在寧夏水稻種質(zhì)資源中的頻率分布Fig.3 Frequency distribution of rice blast resistance genes in Ningxia rice germelasm resources