吳 健 陶 欽 葛 超 薛旭玲 錢 勇 劉紅科

(南京師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，南京 210023)

0 引 言

以順鉑為代表的金屬配合物具有良好的藥理學(xué)特性，引起了人們對金屬抗癌藥物的極大興趣[1-3]，但鉑類藥物毒副作用大、固有或獲得性耐藥性等不足大大限制了鉑類藥物的應(yīng)用，因此新型釕、銥等金屬抗癌藥物逐漸走入人們的視野[4-5]。其中，半三明治有機(jī)金屬配合物因其化學(xué)結(jié)構(gòu)的多樣性和易于控制的芳烴或環(huán)戊二烯基的疏水性而在化學(xué)治療研究中極為突出[6-8]。此外，芳烴或環(huán)戊二烯基不僅有助于提高細(xì)胞對金屬藥物的攝取，而且對生物靶標(biāo)的功能模式和配合物的動力學(xué)惰性也具有重要作用[9-11]。Sadler等報(bào)道此類金屬配合物不同于鉑類藥物的多種作用機(jī)理，具有毒性小、耐藥性低及易代謝等獨(dú)特的優(yōu)勢[12-13]。在此類有機(jī)金屬配合物中，含有各種螯合配體的Ru (Ⅱ)-芳烴配合物表現(xiàn)出優(yōu)異的化學(xué)可修飾性，例如將芳基釕配合物與其他生物活性分子結(jié)合，可以輕松地修改其化學(xué)結(jié)構(gòu)，以調(diào)節(jié)其物理化學(xué)性質(zhì)和生物活性[14-18]。

天然產(chǎn)物因其可修飾的化學(xué)結(jié)構(gòu)、豐富的生物活性以及潛在多功能靶點(diǎn)等優(yōu)勢，也得到了人們的廣泛關(guān)注，目前有科研工作者也將其引入金屬抗癌藥物以提高藥物的生物活性[19-21]。其中，紫蘇醇作為一種治療及預(yù)防癌癥的單萜類口服藥物，曾經(jīng)進(jìn)入臨床二期試驗(yàn)[22-23]，在乳腺癌(IC50≈500 μmol·L?1)[24]、肺癌(IC50≈1 000 μmol·L?1)[25]等多種腫瘤細(xì)胞具有一定的防癌及抗癌作用。紫蘇醇通過在血清中被氧化為紫蘇酸和脫水紫蘇酸來發(fā)揮其抗癌作用[26]。此外，紫蘇醇還可以抑制血管生成[27]，誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞阻滯在G0/G1期，引起p21Cip1/Wafl水平的上調(diào)。但因紫蘇醇口服給藥生物利用度低、給藥劑量大，高劑量的攝入會引起腸道毒性，如導(dǎo)致患者惡心、疲勞和嘔吐等副作用。因此，開發(fā)一種抗腫瘤活性強(qiáng)、毒副作用小的紫蘇醇藥物具有廣泛的應(yīng)用前景。

在本研究中，我們對紫蘇醇進(jìn)行化學(xué)修飾，合成了基于紫蘇醇的新型芳基釕配合物，并通過1H NMR、ESI-MS及元素分析進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。采用MTT法評估了配合物對多種腫瘤細(xì)胞株的抗增殖能力，并利用UV-Vis分光光度計(jì)及熒光光譜儀檢測了配合物與重要生物分子如DNA、BSA及HSA的相互作用，同時(shí)利用流式細(xì)胞術(shù)通過細(xì)胞內(nèi)活性氧生成、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)探討了配合物誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的作用機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑及儀器

實(shí)驗(yàn)所用的化學(xué)藥品和溶劑均為商用分析純，無需進(jìn)一步純化即可直接使用。4，4′-dimethyl-2，2′-bipyridine購自晚晴化學(xué)品公司，根據(jù)文獻(xiàn)方法制備了化合物 4′-methyl-2，2′-bipyridine-4-carboxylic acid[28]和二聚體[Ru(η6-p-cym)Cl2]2[29]。4-二甲氨基吡啶(DMAP)、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDCI)等藥品購自阿拉丁試劑有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)基Dulbecco′s Modified Eagle Medium(DMEM，Invitrogen)、雙抗(含有青霉素和鏈霉素的混合液)和胎牛血清等購自Gibco公司。PBS緩沖溶液、胰蛋白消化酶-EDTA等生物試劑購自南京凱基生物科技有限公司。紫蘇醇購自北京華威銳科化工有限公司。所有的反應(yīng)均在氬氣氛圍下進(jìn)行。

1H NMR使用Bruker AvanceⅡ400 MHz光譜儀檢測。電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)通過使用Mass Lynx系統(tǒng)的Thermo LCQ-FLEET質(zhì)譜儀測定。在PerkinElmer 240C元素分析儀上測量C，H和N的含量。UV-Vis數(shù)據(jù)采用PerkinElmer Lambda 365紫外?可見光譜儀進(jìn)行收集。熒光光譜儀采用Edinburgh FS5型號。使用的多功能酶標(biāo)儀型號為LabServ K3，流式細(xì)胞儀型號為BD FACSverse。

1.2 紫蘇醇化學(xué)修飾配體及配合物的合成

1.2.1 紫蘇醇化學(xué)修飾配體(L)的合成

將 4′-methyl-2，2′-bipyridine-4-carboxylic acid(82.20 mg，0.54 mmol)、紫蘇醇(173.5 mg，0.81 mmol)和DMAP(131.9 mg，1.08 mmol)的DMF溶液在氬氣和冰浴條件下攪拌15 min，然后加入EDCI(207.0 mg，2.0 mmol)，室溫?cái)嚢?4 h。TLC監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，將粗產(chǎn)品用乙酸乙酯(3×20 mL)萃取，用水、鹽水洗滌，并通過快速柱色譜法(石油醚?乙酸乙酯)純化，產(chǎn)物為無色油狀物(100.3 mg，53.3%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ8.89(dd，J=5.0，0.8 Hz，1H)，8.82(dd，J=1.6，0.8 Hz，1H)，8.59(d，J=4.9 Hz，1H)，8.27(s，1H)，7.89(dd，J=5.0，1.7 Hz，1H)，7.34(ddd，J=4.9，1.6，0.7 Hz，1H)，5.88(s，1H)，4.78(s，2H)，4.72(s，2H)，2.44(s，3H)，2.21～2.06(m，4H)，1.97(dd，J=13.8，2.4 Hz，1H)，1.86～1.77(m，1H)，1.71(s，3H)，1.45(tt，J=12.7，8.5 Hz，1H)。13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)：δ164.91，156.99，154.46，150.99，149.74，149.44，148.76,138.55,132.56,126.13,125.99，123.21，121.81，119.60,109.52,69.52,41.22,30.27,27.24，26.28，21.18，21.06。ESI-MS(m/z)：[L+H]+理論值 349.44，實(shí)驗(yàn)值349.32。

1.2.2 配合物[Ru(η6-p-cym)(bpy-POH)Cl]Cl(Ru-L)的合成

將二聚體[Ru(η6-p-cym)Cl2]2(25.0 mg，0.04 mmol)和配體L(28.5 mg，0.08 mmol)的二氯甲烷溶液在氬氣下回流12 h，TCL監(jiān)測至反應(yīng)結(jié)束后旋干溶劑，并將粗產(chǎn)物通過快速柱色譜法(二氯甲烷?甲醇)純化，產(chǎn)物為淺紅色粉末(39.4 mg，75.2%)。1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)：δ9.74(d，J=5.9 Hz，1H)，9.40(d，J=5.8 Hz，1H)，8.92(s，1H)，8.81(s，1H)，8.09(dd，J=5.9,1.6 Hz,1H)，7.69(d，J=5.7 Hz，1H)，6.25(dd，J=9.1，6.3 Hz，2H)，6.02(dd，J=9.4，6.3 Hz，2H)，5.91(s，1H)，4.85(s,2H)，4.73(s，2H)，2.60(s，4H)，2.18(s，7H)，2.02～1.92(m，1H)，1.87～1.78(m，1H)，1.73(s，3H)，1.52～1.42(m，1H)，0.95(d，J=6.9 Hz，6H)。13C NMR(101 MHz，CDCl3)：δ163.09,158.50,156.13,155.14,153.38,151.81,149.34,140.01,131.51,129.58,128.97，127.93，126.98，126.28,123.94,121.65，108.98，104.93，104.44，70.89，40.58,31.18，30.47，27.18，26.53，22.29，22.22，21.56，20.80。ESI-MS(m/z)：[Ru-L?Cl]+理論值619.18，實(shí)驗(yàn)值619.33。元素分析：按C32H38Cl2N2O2Ru計(jì)算值(%)：C 58.71，H 5.85，N 4.28。實(shí)驗(yàn)值(%)：C 59.04，H 5.91，N 4.16。

1.3 細(xì)胞毒性研究

原料紫蘇醇(perillol)、紫蘇醇化學(xué)修飾配體L、配合物Ru-L及其對照藥物順鉑的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)采用MTT(3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyltetrazolium bromide)法測定，選擇人源腫瘤細(xì)胞系卵巢癌(A2780)、卵巢癌的順鉑耐藥株(A2780/DDP)、乳腺癌(MCF-7)和正常人源細(xì)胞肺成纖維細(xì)胞(HLF)進(jìn)行測試。細(xì)胞在DMEM(Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，Gibco BRL)中培養(yǎng)，其中含有10%FBS(胎牛血清，Gibco BRL)，100 μg·mL?1鏈霉素和100 U·mL?1青霉素(Gibco BRL)。將處于對數(shù)生長期的4種細(xì)胞系以每孔5 000個細(xì)胞的初始密度接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在5%(V/V)CO2、310 K條件下培養(yǎng)24 h后，加入待測藥物(藥物溶于1%(V/V)DMSO的DMEM培養(yǎng)基溶液)，繼續(xù)孵育48 h。在每孔加入20μL(5 mg·mL?1)的MTT后繼續(xù)孵育4 h，然后吸去培養(yǎng)基，加入150μL DMSO，振蕩10 min后，使用LabServ K3酶標(biāo)儀讀取492 nm處吸光度值。測得的IC50值是平均值±SEM。

1.4 配合物的水解

通過紫外可見光譜法測定配合物Ru-L的水解常數(shù)及半衰期。制備的純化樣品在H2O(含10%(V/V)DMSO)中的濃度為50 μmol·L?1。在298 K下，24 h內(nèi)以選定的波長(250～550 nm)在15或30 min的間隔內(nèi)記錄吸光度。將吸光度隨時(shí)間變化的圖擬合為適當(dāng)?shù)牡仁健?A=C0+C1e?kt，其中C0和C1是計(jì)算機(jī)擬合的常數(shù)，A是配合物與時(shí)間相對應(yīng)的吸光度)，用于擬合一級反應(yīng)動力學(xué)，以計(jì)算水解速率常數(shù)K和半衰期t1/2。

1.5 配合物與CT-DNA的相互作用

使用配合物Ru-L的DMSO儲備液在PBS(10 mmol·L?1，含有 10 mmol·L?1NaCl，pH 7.4)中稀釋并進(jìn)行DNA結(jié)合實(shí)驗(yàn)。用PBS將CT-DNA稀釋至所需的濃度，并通過UV-Vis光譜測定CT-DNA在260 nm處吸光度值，確定CT-DNA的濃度(ε=6 600 L·mol?1·cm?1)。同時(shí)測定其在280 nm處的吸光度值，A260/A280的比值約為1.87，表明DNA溶液不含蛋白質(zhì)，對DNA滴定實(shí)驗(yàn)沒有干擾。固定每個樣品中配合物的濃度，加入CT-DNA的濃縮儲備液，其中在參比池中每次都要添加等濃度CT-DNA，以最大程度地減少由于DNA在260 nm吸收引起的實(shí)驗(yàn)干擾。將樣品在生理?xiàng)l件下(PBS，10 mmol·L?1，含有 10 mmol·L?1NaCl，pH 7.4)室溫孵育 10 min以達(dá)到結(jié)合平衡，然后記錄配合物Ru-L在302 nm處的吸光度。將配合物Ru-L與CT-DNA的相互作用擬合到Benesi-Hildebrand[30]方程，以計(jì)算結(jié)合常數(shù)Kb。

1.6 配合物與BSA/HSA的相互作用

使用固定濃度的BSA或HSA進(jìn)行熒光猝滅滴定實(shí)驗(yàn)研究配合物與BSA或HSA的相互作用。在PBS(10 mmol·L?1，含有 10 mmol·L?1NaCl，pH 7.4)中制備BSA或HSA儲備溶液并在4℃下保存。每次連續(xù)加入配合物Ru-L并在室溫下孵育10 min以完成相互作用后，記錄不存在和存在配合物Ru-L的情況下 BSA(3.0 μmol·L?1)或 HSA(1.0 μmol·L?1)的熒光發(fā)射光譜，配合物Ru-L的濃度區(qū)間分別設(shè)為0～20μmol·L?1和0～5 μmol·L?1。其中BSA和HSA激發(fā)波長分別為280和278 nm，測定BSA或HSA溶液在334或307 nm處的熒光強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞凋亡檢測

將處于對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞以每孔2×104個細(xì)胞的初始密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在5%(V/V)CO2、310 K條件下培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度(0、11、22和 33 μmol·L?1)的待測藥物(含有1%(V/V)DMSO的DMEM培養(yǎng)基溶液)。繼續(xù)孵育24 h后，消化并收集細(xì)胞。用PBS洗滌2次，加入500μL的binding buffer重懸細(xì)胞，并加入5μL的Annexin VFITC，5 min后加入5μL的propidium iodide混勻，室溫避光靜置15 min，隨后立即使用BD FACSverse流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo 7.6軟件處理數(shù)據(jù)。

1.8 細(xì)胞周期阻滯檢測

將處于對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞以每孔2×104個的初始密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。在5%(V/V)CO2、310 K條件下培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度(0、11、22 和 33 μmol·L?1)的待 測藥物(含 有 1%(V/V)DMSO的DMEM培養(yǎng)基溶液)。繼續(xù)孵育24h后，消化并收集細(xì)胞。用PBS洗滌2次，加入300μL的PBS重懸細(xì)胞，向其中緩慢滴加700μL冰乙醇，277 K過夜固定細(xì)胞。固定結(jié)束后，2 000 r·min?1離心5 min，PBS洗滌，加入提前配好的碘化丙啶染色液(PI/RNase A，9∶1，V/V)，室溫下避光靜置30 min，隨后立即使用BD FACSverse流式細(xì)胞儀檢測，使用FlowJo 7.6軟件處理數(shù)據(jù)。

1.9 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測

將處于對數(shù)生長期的A2780細(xì)胞以每孔2×104個的初始密度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在5%(V/V)CO2、310 K條件下培養(yǎng)24 h后，加入不同濃度(0、11、22和33 μmol·L?1)的待測配合物 Ru-L(含有 1%(V/V)DMSO的DMEM培養(yǎng)基溶液)。繼續(xù)孵育4h后，收集細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)基洗滌2次，并向其中加入10 μmol·L?1活性氧探針H2DCFDA，避光繼續(xù)孵育20 min。PBS洗滌2次后收集細(xì)胞并用PBS重懸細(xì)胞。隨后立即使用BD FACSverse流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為510～540 nm，使用FlowJo 7.6軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成和表征

選擇具有抗腫瘤活性的天然產(chǎn)物紫蘇醇對其進(jìn)行化學(xué)修飾，引入同樣具有抗腫瘤活性的芳基釕配合物，希望結(jié)合紫蘇醇和芳基釕的雙重作用，提高配合物Ru-L的抗腫瘤效果。紫蘇醇化學(xué)修飾配體L是由紫蘇醇和4′-methyl-2，2′-bipyridine-4-carboxylic acid在DMF中通過酰胺化反應(yīng)，并通過柱層析分離提純制得。芳基二聚體[Ru(η6-p-cym)Cl2]2是由RuCl3·3H2O與α-松油烯在甲醇中制備得到。配合物Ru-L由芳基二聚體[Ru(η6-p-cym)Cl2]2與配體L直接在二氯甲烷中反應(yīng)，并通過柱層析分離提純制得(如圖1所示)。利用1H NMR、13C NMR、ESI-MS及元素分析對配體L和配合物Ru-L進(jìn)行了表征。

圖1 配體L及配合物Ru-L的合成路線Fig.1 Synthetic route of ligand L and complex Ru-L

2.2 細(xì)胞毒性研究

通過MTT法研究了紫蘇醇、紫蘇醇化學(xué)修飾配體L以及配合物Ru-L對人源腫瘤細(xì)胞株A2780、A2780順鉑耐藥株(A2780DDP)、MCF-7和正常細(xì)胞HLF 48 h的體外細(xì)胞毒性，并以順鉑作為陽性對照藥物。從表1可以看出，紫蘇醇和配體L對人源腫瘤細(xì)胞及正常細(xì)胞毒性較小(IC50＞200 μmol·L?1)，與文獻(xiàn)報(bào)道數(shù)值相一致[21,31]，遠(yuǎn)低于順鉑的細(xì)胞毒性。與天然產(chǎn)物、相應(yīng)配體及[Ru(η6-p-cym)Cl2]2(IC50＞200μmol·L?1)相 比[32]，配 合 物 Ru-L 對 A2780 細(xì) 胞 、A2780/DDP細(xì)胞及MCF-7細(xì)胞的毒活性顯著提高，其IC50值分別為22、40和34 μmol·L?1。同時(shí)對人正常細(xì)胞HLF毒性較小(IC50＞200 μmol·L?1)，表明引入天然產(chǎn)物紫蘇醇后配合物Ru-L不僅可以顯著提高對腫瘤細(xì)胞的毒性，而且對正常細(xì)胞具有較低的毒副作用。為了探究配合物Ru-L對多種腫瘤細(xì)胞株毒活性提高的原因，我們深入研究了配合物Ru-L的水解速率，與重要生物分子如DNA、BSA和HSA的相互作用，以及誘導(dǎo)A2780細(xì)胞死亡的作用機(jī)理。

表1 紫蘇醇、配體L及配合物Ru-L對不同腫瘤細(xì)胞株的48 h的IC50值Table 1 IC50values towards different cells by perillol,L and complex Ru-L for 48 h μmol·L?1

2.3 配合物的水解

芳基金屬配合物通過水解來調(diào)控其藥理學(xué)性質(zhì)，如細(xì)胞攝取、細(xì)胞毒性及與DNA的相互作用等[33-34]，其中配合物水解后可與DNA的堿基發(fā)生配位，進(jìn)而影響DNA的轉(zhuǎn)錄及翻譯等生理功能[35]。因此我們利用UV-Vis光譜研究配合物Ru-L(50μmol·L?1)在含有10%(V/V)DMSO的水溶液中的水解速率。如圖2所示，配合物Ru-L的特征吸收峰為278、296、314、318及398 nm，其中，在278和296 nm處較強(qiáng)的特征峰歸屬于MLCT/LLCT躍遷，在314和318 nm處的特征峰為離去基團(tuán)Cl的π軌道躍遷到π*所引起的LLCT躍遷，其中398 nm處的特征峰為Ru原子4d軌道上的電子向配體的π*空軌道MLCT躍遷所致[36-37]。在298 K，100 min之內(nèi)，配合物Ru-L水溶液中吸收峰發(fā)生了明顯的變化，在296 nm處的吸收峰減弱(減弱率為7.72%)，在278、314、318及398 nm處的吸收峰增強(qiáng)(增強(qiáng)率分別為12.16%、3.63%、8.26%及15.91%)，表明配合物發(fā)生了水解。利用一級反應(yīng)動力學(xué)方程求導(dǎo)得到ln(C/C0)與時(shí)間的關(guān)系，其中C0是初始時(shí)配合物的濃度，C是對應(yīng)時(shí)間時(shí)配合物的濃度。并通過在0～100 min之內(nèi)的斜率因子計(jì)算出配合物的水解速率常數(shù)和半衰期分別為1.31 h?1和0.53 h，表明配合物Ru-L在298 K的水溶液環(huán)境中具有較快的水解速率[8]。

圖2 配合物Ru-L在水溶液中的紫外吸收光譜圖Fig.2 Ultraviolet absorption spectrum of complex Ru-L in H2O solution

2.4 配合物Ru-L與CT-DNA的相互作用

DNA是芳基金屬配合物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)潛在靶點(diǎn)之一，研究DNA和芳基金屬配合物的相互作用在研究抗腫瘤機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。常用紫外?可見光譜研究配合物與小牛胸腺DNA(CT-DNA)可能的結(jié)合模式及其結(jié)合常數(shù)Kb[38]。配合物通過嵌入作用與DNA的堿基對發(fā)生電子堆積，配體的π*軌道與DNA堿基對的π軌道發(fā)生耦合導(dǎo)致能級下降，耦合后的π*軌道部分被電子填充，使其π-π*躍遷幾率減小，從而產(chǎn)生減色效應(yīng)或紅移現(xiàn)象[39]。通過 UV-Vis光譜研究配合物Ru-L(30 μmol·L?1)在含有 10%(V/V)DMSO 的 PBS(10 mmol·L?1，pH 7.4)中的結(jié)合常數(shù)Kb。如圖3所示，在配合物溶液中滴加CTDNA時(shí)，在314～318 nm處觀察到了明顯的減色效應(yīng)，其中在CT-DNA的濃度為40 μmol·L?1時(shí)，配合物的減色效應(yīng)高達(dá)21.36%。

圖3 配合物Ru-L在PBS中滴加CT-DNA后的紫外吸收光譜圖Fig.3 Ultraviolet absorption spectra of complex Ru-L after the addition of CT-DNA in PBS

將配合物Ru-L與CT-DNA的相互作用擬合到Benesi-Hildebrand方程，以計(jì)算結(jié)合常數(shù)Kb：

其中CDNA是CT-DNA的濃度，表觀吸收系數(shù)εa對應(yīng)于Aobs/CRu-L，εb和εf分別表示結(jié)合態(tài)和游離態(tài)的配合物的消光系數(shù)。將CDNA/(εa?εf)與CDNA的關(guān)系進(jìn)行線性擬合，并通過斜率因子與截距的比值計(jì)算出配合物與DNA的結(jié)合常數(shù)Kb為4.37×105L·mol?1，相比之前文獻(xiàn)報(bào)道[40]，配合物Ru-L與DNA具有更強(qiáng)的結(jié)合能力，并以嵌入的方式與CT-DNA相互作用，這種結(jié)合方式在抗腫瘤藥物的設(shè)計(jì)和開發(fā)中發(fā)揮著重要作用。

2.5 配合物與BSA/HSA的相互作用

血清白蛋白(SA)是血漿中的主要蛋白質(zhì)，是激素、脂類等物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，因此研究藥物?白蛋白之間的相互作用對藥物的運(yùn)輸、釋放、生物分布和毒性至關(guān)重要[41]。在本文中，研究基于芳基釕的抗癌藥物和SA的相互作用對于理解芳基釕的藥代動力學(xué)和藥物?蛋白質(zhì)相互作用非常重要。因此，我們以牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)為模式蛋白研究了Ru-L與SA的相互作用。

BSA的結(jié)構(gòu)類似于HSA，且更易獲得。BSA產(chǎn)生熒光的生色團(tuán)是由蛋白質(zhì)的色氨酸(Trp)和酪氨酸(Tyr)引起的。BSA蛋白中由色氨酸的發(fā)射光譜發(fā)生變化所引起的構(gòu)象轉(zhuǎn)換與結(jié)合的底物或變性反應(yīng)相關(guān)[42]。我們利用熒光光譜研究配合物在含有1%(V/V)DMSO 的 PBS(10 mmol·L?1，pH 7.4)溶液中與BSA(3 μmol·L?1)的熒光猝滅常數(shù)及其結(jié)合常數(shù)Ka。如圖4所示，在BSA溶液中滴加配合物Ru-L(0～20μmol·L?1)，可觀察到BSA在334 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度急劇下降(降低率為48.68%)，表明配合物與BSA有很強(qiáng)的相互作用。有研究表明，BSA熒光猝滅的性質(zhì)可以是“靜態(tài)淬滅”或“動態(tài)淬滅”[43]。靜態(tài)機(jī)制通常是由猝滅劑和熒光團(tuán)之間的基態(tài)結(jié)合物形成引起的，因此，它會引起熒光團(tuán)吸收光譜的擾動。而在動態(tài)機(jī)制中，熒光團(tuán)和猝滅劑在激發(fā)態(tài)下彼此接觸，因此BSA的吸收光譜強(qiáng)度沒有明顯的變化。熒光光譜實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明配合物對BSA熒光猝滅性質(zhì)是“靜態(tài)猝滅”，其熒光猝滅機(jī)制可以用經(jīng)典Stern-Volmer[44]方程式表示：

圖4 配合物Ru-L在PBS中滴加BSA后的熒光光譜圖:(A)BSA熒光強(qiáng)度隨配合物濃度變化曲線,其中插圖為BSA在334 nm處熒光強(qiáng)度對配合物濃度的擬合曲線;(B)Stern-Volmer方程擬合;(C)lg[(F0?F)/F]與 lgCQ擬合線性方程Fig.4 Fluorescence spectra of complex Ru-L after addition of BSA in PBS:(A)BSA fluorescence intensity as a function of complex concentration,where the illustration is the fitting curve of BSA fluorescence intensity at 334 nm;(B)Stern-Volmer equation fitting;(C)lg[(F0?F)/F]and lgCQfitting for the linear constants corresponding to the binding constants and complex numbers

其中F0和F分別是不存在和存在金屬配合物(Q)的情況下的熒光強(qiáng)度；Ksv是Stern-Volmer淬滅常數(shù)，可以通過F0/F對CQ作圖，由擬合直線的斜率獲得。使用熒光和濃度數(shù)據(jù)的雙對數(shù)曲線，可以通過截距和斜率計(jì)算得到結(jié)合常數(shù)Ka和與BSA結(jié)合的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)：

由公式(2)、(3)可算得配合物Ru-L與BSA相互作用的Stern-Volmer淬滅常數(shù)Ksv、雙分子淬滅常數(shù)Kq、結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為 4.8×104L·mol?1、4.8×1012L·mol?1·s?1、2.0×104、1(表 2)。BSA 主要有2個Trp殘基發(fā)射內(nèi)源熒光，其中一個Trp位于BSA分子內(nèi)部疏水腔的Trp-212位點(diǎn)；另一個位于分子表面的Trp-134。由于Trp-134在親水環(huán)境會發(fā)生熒光猝滅，所以BSA分子的內(nèi)源熒光主要由處于疏水腔的Trp-212產(chǎn)生[31]。因此，可以推斷配合物Ru-L引起B(yǎng)SA熒光“靜態(tài)猝滅”的主要原因是配合物影響Trp-212的疏水環(huán)境，從而改變BSA蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，引起熒光猝滅。

由于牛血清白蛋白(BSA)成本低且被廣泛使用，在許多生化和藥理學(xué)應(yīng)用中可以作為人血清白蛋白(HSA)的替代品。但實(shí)際上，BSA僅具有HSA的75.8%的生物學(xué)功能，因此在許多應(yīng)用中無法替代HSA[45]。HSA是585個氨基酸的球狀蛋白，約占血清總蛋白的60%。它對廣泛的內(nèi)源性和外源性配體具有出色的結(jié)合能力，并且其豐度使其成為許多藥物的藥代動力學(xué)行為的重要決定因素?？筛鶕?jù)配合物與HSA的親和程度來研究藥物進(jìn)入組織的分布情況和藥物代謝情況。利用熒光光譜研究配合物在含有 1%(V/V)DMSO 的 PBS(10 mmol·L?1，pH 7.4)溶液中與HSA(1μmol·L?1)的熒光猝滅常數(shù)及其結(jié)合常數(shù)Ka。如圖5所示，在HSA溶液中滴加配合物Ru-L，可觀察到HSA在307 nm處的發(fā)射峰強(qiáng)度明顯下降(降低率為20.17%)，表明配合物與HSA有較強(qiáng)的相互作用。由經(jīng)典Stern-Volmer公式得到配合物Ru-L與HSA相互作用的Stern-Volmer淬滅常數(shù)Ksv、雙分子淬滅常數(shù)Kq、結(jié)合常數(shù)Ka及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n分別為 4.8×104L·mol?1、4.8×1012L·mol?1·s?1、5.1×104、1(表2)。HSA中產(chǎn)生熒光的生色團(tuán)是由蛋白質(zhì)的Trp、Tyr以及丙烯氨酸(Phe)引起的，其中Trp對熒光的貢獻(xiàn)率超過95%。研究表明，HSA中有2個主要的結(jié)構(gòu)選擇性結(jié)合位點(diǎn)，即Ⅰ位和Ⅱ位[46-48]，當(dāng)Ksv＞103L·mol?1時(shí)，表明配合物對HSA的熒光猝滅是“靜態(tài)猝滅”過程，且主要是由色氨酸及酪氨酸對HSA的微環(huán)境改變所致[49]。綜上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，配合物Ru-L改變HSA的微環(huán)境導(dǎo)致其熒光“靜態(tài)猝滅”。

表2 配合物Ru-L對BSA/HSA的熒光猝滅數(shù)據(jù)Table 2 Fluorescence quenching data of complex Ru-L on BSA/HSA

圖5 配合物Ru-L在PBS中滴加HSA后的熒光光譜圖:(A)HSA熒光強(qiáng)度隨Ru-L濃度變化曲線,其中插圖為HSA在307 nm處熒光強(qiáng)度對配合物濃度的擬合曲線;(B)Stern-Volmer方程對應(yīng)雙分子猝滅常數(shù);(C)lg[(F0?F)/F]與lgCQ擬合線性方程對應(yīng)結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)Fig.5 Fluorescence spectra of complex Ru-L after HSA was added dropwise in PBS:(A)Curve of HSA fluorescence intensity as a function of Ru-L concentration,where the inset is a fitting curve of HSA fluorescence intensity at 307 nm versus complex concentration;(B)Stern-Volmer equation corresponding to the bimolecular quenching constant;(C)lg[(F0?F)/F]and lgCQfitting for the linear constant corresponding to the binding constant and complex number

2.6 細(xì)胞內(nèi)活性氧(ROS)的檢測

正常細(xì)胞通過控制適當(dāng)?shù)幕钚匝?ROS)水平來調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞死亡等生理過程[50]。有文獻(xiàn)報(bào)道紫蘇醇是通過氧化應(yīng)激反應(yīng)抑制了Ras/Raf/ERK通路，從而誘導(dǎo)細(xì)胞了死亡[51]。因此為了研究配合物Ru-L引起細(xì)胞死亡的機(jī)理，我們選擇具有細(xì)胞膜穿透性的ROS熒光探針H2DCFDA檢測了腫瘤細(xì)胞中ROS水平。H2DCFDA在細(xì)胞內(nèi)被酯酶氧化或水解，生成無熒光的DCFH。細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS可以將DCFH氧化為有熒光的DCF，因此可通過DCF的熒光強(qiáng)度來指示細(xì)胞內(nèi)ROS的水平[52]。我們先將配合物在A2780細(xì)胞中孵育4 h，然后加入ROS熒光探針繼續(xù)孵育30 min，利用流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS水平的變化。如圖6所示，我們觀察到A2780細(xì)胞中相對熒光強(qiáng)度僅從41.5上升到67.0，此結(jié)果相比于同類型金屬配合物的ROS水平變化(大于100倍)差距較大，這表明引入紫蘇醇配體的配合物Ru-L無法誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過量的ROS，改變了紫蘇醇通過干擾氧化應(yīng)激通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡的方式。

圖6 A2780細(xì)胞中配合物Ru-L誘導(dǎo)的活性氧生成:(A)熒光強(qiáng)度柱狀圖;(B)熒光強(qiáng)度分布統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.6 ROS generation induced by complex Ru-L in A2780 cells:(A)histogram of fluorescence intensity;(B)statistical results of fluorescence intensity distribution

2.7 配合物誘導(dǎo)A2780的細(xì)胞凋亡

配合物Ru-L不是通過干擾細(xì)胞的氧化應(yīng)激通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，因此我們利用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)一步研究了Ru-L的作用機(jī)理。腫瘤細(xì)胞的死亡方式有細(xì)胞凋亡、自噬、壞死、焦亡及鐵死亡等[53-54]，其中細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的過程，多數(shù)配合物通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其細(xì)胞毒性。為了深入了解配合物Ru-L對腫瘤細(xì)胞毒活性的提升是否由細(xì)胞凋亡引起，我們將A2780細(xì)胞用0～33 μmol·L?1濃度的配合物孵育24 h后，通過流式細(xì)胞儀檢測了細(xì)胞的凋亡效果。結(jié)果如圖7所示，我們觀察到配合物Ru-L誘導(dǎo)A2780細(xì)胞的凋亡效果以劑量依賴性的方式上升，細(xì)胞凋亡的百分?jǐn)?shù)由0.597%上升到26.2%。其中配合物濃度達(dá)到1.5倍的IC50時(shí)，可誘導(dǎo)11.4%的A2780細(xì)胞早期凋亡及14.8%的細(xì)胞晚期凋亡。該結(jié)果表明配合物Ru-L通過誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡來發(fā)揮其抗腫瘤效果。

2.8 配合物誘導(dǎo)A2780的細(xì)胞阻滯

細(xì)胞周期主要分為間期和分裂期，其中細(xì)胞間期包括DNA復(fù)制的合成前期(G1)、DNA合成期(S)以及DNA合成后期(G2)。有文獻(xiàn)報(bào)道紫蘇醇及其衍生物誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞阻滯在G2/M期，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[55]。為了深入了解配合物Ru-L對周期阻滯的影響，我們將A2780細(xì)胞用0～33 μmol·L?1濃度的配合物孵育24 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的周期阻滯效果。結(jié)果如圖8所示，A2780細(xì)胞的G0/G1期的細(xì)胞百分?jǐn)?shù)由56.14%增加到74.08%，這就表明配合物Ru-L不同于紫蘇醇對腫瘤細(xì)胞的G2/M期阻滯，而將A2780細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，從而誘導(dǎo)A2780細(xì)胞凋亡。

圖7 配合物Ru-L對A2780細(xì)胞凋亡圖:(A)細(xì)胞群落分布;(B)細(xì)胞群落柱狀圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.7 Apoptosis of A2780 cells by complex Ru-L:(A)cell distribution;(B)histogram of cell statistical results

圖8 配合物Ru-L對A2780細(xì)胞周期阻滯效果:(A)細(xì)胞阻滯分布;(B)細(xì)胞阻滯柱狀圖統(tǒng)計(jì)結(jié)果Fig.8 Effect of complex Ru-L on A2780 cell cycle arrest:(A)cell arrest distribution;(B)histogram of cell arrest statistical results

3 結(jié) 論

將天然產(chǎn)物紫蘇醇進(jìn)行化學(xué)修飾后引入芳基釕配合物中，得到了一種基于天然產(chǎn)物的芳基金屬配合物Ru-L，并研究了配合物對人源腫瘤A2780、A2780/DDP及MCF-7細(xì)胞和人正常HLF細(xì)胞的抗癌活性，探究了影響芳基釕配合物抗腫瘤活性的因素。研究結(jié)果表明配合物Ru-L對腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出很高的細(xì)胞毒活性，并且對正常細(xì)胞的毒性要遠(yuǎn)低于順鉑。Ru-L具有較快的水解速度，可以嵌入DNA發(fā)生堿基堆積作用，同時(shí)還可以改變BSA/HSA的疏水環(huán)境，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。此外，配合物通過將腫瘤細(xì)胞阻滯在G0/G1期誘導(dǎo)A2780細(xì)胞的凋亡，不同于紫蘇醇誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制?？傊?，將紫蘇醇引入到芳基釕配合物中，不僅提高了紫蘇醇的抗癌活性，克服了紫蘇醇劑量大、毒性大的缺點(diǎn)，而且拓展了芳基金屬配合物在抗腫瘤活性方面的應(yīng)用，這些結(jié)果將為芳基金屬抗腫瘤藥物的研發(fā)提供一定的指導(dǎo)意義。