黃福燈 趙超越 吳鑫 賀煥煥 程方民 李春壽 潘剛

(1浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 作物與核技術(shù)利用研究所, 杭州 310021; 2浙江大學(xué) 農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院, 杭州 310058; #共同第一作者; *通信聯(lián)系人, E-mail:lichunshou@126.com)

葉片是水稻最重要的源器官，其功能與衰老對產(chǎn)量與品質(zhì)具有重要影響[1-2]。研究表明，水稻灌漿后期功能葉每推遲1 d衰老，理論上增產(chǎn)約2%，實際增產(chǎn)約1%，同時還能改善稻米品質(zhì)[3-4]。水稻葉色變異是一類易于鑒定的突變性狀，該性狀不僅常作為形態(tài)標記應(yīng)用于水稻分子育種，同時該類突變體也是研究水稻功能基因組，尤其是光系統(tǒng)、葉綠素合成代謝以及葉綠體的遺傳分化及發(fā)育的重要材料[5-6]。水稻常見的葉色變異主要包括轉(zhuǎn)綠型、條紋、黃化、白化、斑馬紋以及黃色斑等 6種類型。關(guān)于葉色變異的成因，科研工作者基于各類突變體材料的研究結(jié)果，證實其根本原因在于葉綠體合成

與發(fā)育的受阻，因此任何涉及葉綠素生物合成代謝、血紅素-光敏色素合成代謝、葉綠體發(fā)育、光合系統(tǒng)及其他生物合成代謝途徑中的關(guān)鍵基因突變均會導(dǎo)致葉色突變[7]。基于正向或反向遺傳學(xué)手段，國內(nèi)外對水稻黃葉突變進行了大量研究并克隆了YE1[8]、IspE[9]、YL-1[10]和 LYL1[11]等黃葉基因。

本課題組前期利用60Co輻射誘變中秈恢復(fù)系自選 1號，從中獲得黃葉早衰突變體，暫命名為osyes1(Oryza sativa yellow-leaf and early senescence 1)。該突變體黃葉表型始于水稻幼苗期(約3～4片葉齡時)，之后隨著葉齡的增加，除植株最上面一片完整展開葉外，其他葉片均不同程度黃化早衰，至抽穗后所有葉片均黃化早衰。我們對突變體osyes1的基本表型、生理特性進行分析，并對相應(yīng)基因進行定位，為進一步克隆該基因并揭示其黃葉早衰分子生理機理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

黃葉早衰突變體osyes1來源于持久高抗稻瘟病中秈恢復(fù)系自選 1號(來源于恩施農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所)的60Co輻射誘變后代，經(jīng)杭州和海南連續(xù)多代回交和自交，突變性狀已穩(wěn)定遺傳。之后配制osyes1/自選 1號、osyes1/浙恢 7954和 osyes1/常規(guī)粳稻02428等3個雜交組合，利用F1及其自交F2群體進行遺傳分析和基因定位。所有材料均種植于浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院楊渡科研創(chuàng)新基地，常規(guī)肥水管理。水稻成熟后，分別取osyes1及自選1號各20株，對其株高、穗長、有效穗數(shù)、每穗粒數(shù)、結(jié)實率和千粒重等主要農(nóng)藝性狀進行考種分析。

1.2 幼苗外源H2O2處理

選取突變體osyes1及自選1號的成熟種子并脫殼，經(jīng)70%酒精消毒1 min后，再用10%次氯酸鈉消毒15 min，之后無菌水充分洗滌5次。將消毒好的糙米接種在含 0、40和 60 mmol/L H2O2的 1/2 MS[12]固體培養(yǎng)基上，置于光強控制在 7000 Lx、光周期為16 h光照/8 h黑暗、28℃的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)，7 d后統(tǒng)計根長及株高。

1.3 透射電鏡分析

選取抽穗當(dāng)天突變體osyes1及自選1號的劍葉中部邊緣葉片，剪成1 mm×2 mm樣本，迅速放入用0.1 mmol/L (pH 7.2)的磷酸緩沖液配制的2.5%戊二醛溶液中，抽真空至樣品完全浸沒，4℃下固定24 h。依據(jù)Yang等[13]方法制備樣品并于JEM-1230透射電鏡下觀察并拍照。

1.4 生理指標測定

選取突變體osyes1及自選1號處于孕穗期(劍葉葉枕與倒2葉葉枕重合的分蘗)的劍葉、倒2葉和倒 3葉的中部葉片，根據(jù)龔盼等[14]和 Gong等[15]的方法分別測定葉綠素含量、過氧化氫(H2O2)、超氧陰離子(O2-)、丙二醛(MDA)和可溶性蛋白含量、以及過氧化氫酶(CAT)、過氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性。同時，根據(jù)Pan等[16]的方法，用Li-6400XT光合儀測定劍葉、倒2葉和倒3葉的光合速率。每個生理指標5個重復(fù)。

1.5 遺傳分析與基因定位

大田栽培條件下，考查osyes1/自選1號、osyes1/浙恢7954和osyes1/常規(guī)粳稻02428的F1雜種葉色，確定控制突變體黃葉早衰癥狀的顯隱性；同時，根據(jù)osyes1/自選1號及osyes1/浙恢7954的F2群體中具有正常葉色的水稻單株數(shù)與具有突變體性狀的單株數(shù)的比例，確定控制黃葉早衰性狀的基因數(shù)量。而后，分單株剪取osyes1/02428的F2群體中具有突變體性狀的單株、osyes1、02428以及F2群體中10株具有野生型表型的植株葉片，采用CTAB法提取基因組總DNA。選取SSR(http: //www.gramene.org/)及InDel[17]分子標記，利用BSA法進行基因連鎖分析及基因定位。

圖1 突變體osyes1及其野生型的表型Fig. 1. Phenotype of osyes1 and its WT plants at different growth stages.

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體osyes1的表型及主要農(nóng)藝性狀

突變體 osyes1的葉片在苗期(3～4葉期)就表現(xiàn)為黃葉早衰癥狀(圖 1-A)，且除上部一片完整展開葉外，其他葉片在完整展開5～7 d后，葉尖開始變黃并逐步擴展至葉中部，甚至整個葉片。之后隨著葉齡增長，至抽穗開花早期(圖1-B)，突變體僅有劍葉維持正常綠色(圖1-C)，而后，包括劍葉在內(nèi)，所有葉片逐漸黃化衰老，到水稻成熟期，所有葉片全部表現(xiàn)嚴重黃化衰老癥狀(圖 1-D)。抽穗當(dāng)天突變體葉片的部分葉綠體的類囊體已開始降解(圖1-H)，而且其葉綠體中的淀粉顆粒(圖 1-G)明顯少于對照(圖 1-E)。由于葉片黃化早衰，導(dǎo)致突變體 osyes1的主要農(nóng)藝性狀，如株高、穗長、每穗粒數(shù)和結(jié)實率極顯著低于野生型對照，分別下降 11.13%、20.42%、32.18%和41.94%(表1)。

2.2 突變體osyes1對H2O2的響應(yīng)特性

突變體osyes1及自選1號在不同H2O2濃度(0、40和60 mmol/L)的1/2 MS固體培養(yǎng)基上生長7 d后，測量其株高及根長。結(jié)果顯示，正常條件下突變體osyes1及自選1號之間的株高和根長均無明顯差異；而在 H2O2處理條件下，盡管兩者的根長均完全受到抑制，且株高也明顯受到抑制，但與野生型相比，osyes1的株高受抑更明顯。與對照相比，經(jīng)40和60 mmol/L H2O2處理后的突變體株高分別降低 25.85%和 27.97%(圖 2)。

2.3 突變體osyes1的生理性狀

2.3.1 葉綠素含量及其光合效率分析

孕穗期突變體osyes1的劍葉、倒2葉和倒3葉的葉綠素a(圖3-A)、葉綠素b(圖3-B)、葉綠素總含量(圖 3-C)及葉綠素 a/b比值(圖 3-D)均極顯著低于野生型自選1號。與野生型自選1號相比，突變體osyes1的劍葉、倒2葉和倒3葉的總?cè)~綠素含量分別下降35.66%、55.17%和53.85%(圖3-C)。葉片中的光合色素是吸收、傳遞光能的載體，其含量對光合作用效率具有十分重要的作用[18]。因此，進一步測定突變體osyes1及其野生型的凈光合速率。結(jié)果顯示，突變體劍葉、倒2葉和倒3葉的凈光合速率極顯著低于野生型對照，分別下降16.24%、35.65%和 43.93%(圖 3-E)。

表1 突變體及其野生型的主要農(nóng)藝性狀Table 1. Main agronomic traits of osyes1 and its wild type (WT) plants.

圖2 H2O2脅迫下osyes1突變體及其野生型(WT)的表型Fig. 2. Phenotype of osyes1 mutant and its wild type (WT)plants under H2O2 exposure.

2.3.2 活性氧含量及抗氧化酶活性分析

圖4-A和B顯示，野生型及突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉間的H2O2和O2-含量依次增加，且突變體極顯著高于野生型。與野生型相比，突變體的劍葉、倒2葉和倒3葉的H2O2分別增加13.52%、12.64%和 69.29%(圖 4-A)，而其 O2-含量則依次增加 38.24%、311.61%和 80.68%(圖 4-B)。為了清除植物體內(nèi)過多活性氧，如H2O2和O2-，防止其對細胞造成損傷，植物會及時啟動多種保護酶系統(tǒng)，如超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)和過氧化物酶(POD)等抗氧化酶[19]。故此，分別測定突變體osyes1及其野生型葉片中的3種酶活。圖4-C顯示，突變體的 SOD酶活與野生型無顯著性差異。而圖4-D和圖4-E結(jié)果顯示，突變體和野生型的劍葉、倒2葉與倒3葉的CAT和POD酶活依次下降，但前者低于后者。與野生型相比，除劍葉外，突變體倒2葉與倒3葉的CAT酶活極顯著下降，降幅分別為39.79%和44.24%(圖4-D)。而突變體劍葉、倒2葉和倒3葉的POD則極顯著低于野生型對照，分別減少65.47%、77.55%和55.27%(圖4-E)。

2.3.3 丙二醛(MDA)和可溶性蛋白含量

圖5-A顯示，野生型及突變體osyes1的劍葉、倒2葉和倒3葉間的MDA含量依次極顯著增加。與野生型相比，osyes1劍葉、倒 2葉和倒 3葉的MDA含量分別增加30.85%、549.00%和562.66%。圖5-B顯示，野生型劍葉、倒2葉和倒3葉間的可溶性蛋白含量無顯著性差異，但突變體osyes1則極顯著低于野生型且依次極顯著降低。與野生型相比，突變體osyes1劍葉、倒2葉和倒3葉的可溶性蛋白含量分別下降11.15%、29.78%和42.35%。

2.4 遺傳分析及基因定位

osyes1/自選1號和osyes1/浙恢7954的F1單株表現(xiàn)為正常葉色，說明osyes1的黃葉早衰癥狀是隱性性狀。進一步統(tǒng)計F2群體所有單株的田間葉色結(jié)果表明，具野生型葉色的單株與具突變體性狀的單株之比均符合3∶1的分離比(表2)，從而證實osyes1的黃葉早衰性狀受單位點隱性核基因控制。

圖3 孕穗期突變體osyes1及其野生型葉片的葉綠素含量及其凈光合速率Fig. 3. Chlorophyll (chl) levels and net photosynthetic rate of leaves in osyes1 and its WT plants at the booting stage.

圖4 孕穗期突變體osyes1及其野生型葉片中的H2O2和O2-含量及抗氧化酶活性Fig. 4. H2O2 and O2- levels, and the activities of antioxidases in osyes1 and its WT plants at booting stage.

圖5 孕穗期突變體osyes1及其野生型葉片的MDA和可溶性蛋白含量Fig. 5. MDA and soluble protein contents of leaves in osyes1 and its WT plants at booting stage.

表2 突變體osyes1的遺傳分析Table 2. Genetic analysis of the mutant osyes1.

圖6 水稻黃葉早衰基因OsYES1在第7染色體上的分子定位Fig. 6. Molecular mapping of OsYES1 gene on the short arm of chromosome 7.

利用osyes1/02428的F2群體中具有突變體性狀的414個單株作為基因定位群體。合成分布于水稻12條染色體上的600對SSR標記及50對InDel標記，逐條分析其在02428和突變體osyes1間的多態(tài)性。選用親本間具有多態(tài)性且均勻分布在 12條染色體上的分子標記，利用 BSA法分析分子標記與突變性狀間的連鎖關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)水稻第7染色體上的SSR標記RM1186、RM21339、RM7338以及InDel標記R7M20在突變體基因池和正?；虺刂g存在明顯偏分離，說明OsYES1位于第7染色體。進一步利用414個突變體單株驗證以上標記，初步把OsYES1定位在RM21339和R7M20之間(圖6)。為進一步精細定位OsYES1，利用 RM21339和R7M20之間的2對多態(tài)性SSR標記(RM21353和RM21384)，將OsYES1定位在RM21353與RM21384之間，物理距離約為708 kb，區(qū)間橫跨AP005172、AP005880、AP005673、AP005475、AP005104、AP005189和AP005260等7個BAC(圖6)，其間有表達序列標簽支持且在葉中表達的開放閱讀框為15 個(表 3)。

表3 定位區(qū)間內(nèi)在葉中表達的基因功能注釋Table 3. Functional annotations of genes expressed in leaves within the target interval.

3 討論

葉片是水稻進行光合作用的最重要場所，葉色變異將導(dǎo)致其光合作用受阻，進而影響有機物如淀粉的累積，最終影響產(chǎn)量與品質(zhì)。因此，葉綠素含量、葉綠素a/b以及葉片凈光合速率是衡量葉色突變的重要生理指標[18]。本研究所用黃葉早衰突變體osyes1，其黃葉早衰癥狀始于幼苗期(圖1-A)，抽穗早期除劍葉外所有葉片均不同程度黃化(圖1-B、C)，而且此時期的突變體劍葉的部分葉綠體的類囊體已開始降解(圖1-H)，進而導(dǎo)致其光合速率下降（圖3-E）并減少淀粉粒在突變體葉綠體中的累積。同時，葉綠素含量及其a/b結(jié)果表明，突變體osyes1劍葉、倒2葉和倒3葉的總?cè)~綠素含量極顯著低于其野生型自選1號(圖3-C、D)。

伴隨葉片黃化早衰，葉綠體中的電子傳遞鏈將受到抑制，致使活性氧簇大量產(chǎn)生并成為植物細胞響應(yīng)非生物脅迫以及衰老的最早反應(yīng)之一[19-21]。同時，過量 ROS將作用于細胞膜脂質(zhì)，使其過氧化而產(chǎn)生大量MDA，所以MDA也是衡量細胞死亡、葉片衰老的重要生理指標[22]。本研究中野生型對照自選1號的劍葉、倒2葉和倒3葉間的H2O2含量無顯著性差異，而突變體osyes1的含量則依次增加且極顯著高于野生型自選1號(圖 4-A)，而且與野生型相比，突變體對H2O2更敏感(圖2)。野生型倒3葉的MDA和O2-含量極顯著高于劍葉和倒2葉，而突變體osyes1的劍葉、倒2葉和倒3葉間的含量均依次極顯著增加(圖4-B)。此外，蛋白質(zhì)含量特別是可溶性蛋白質(zhì)含量的下降也是衡量葉片衰老的重要指標之一[18]。本研究中野生型的劍葉、倒2葉和倒3葉之間的可溶性蛋白含量無顯著性差異，而突變體osyes1的含量依次極顯著降低(圖 5-B)。為了清除細胞內(nèi)的過多 ROS并保護細胞膜系統(tǒng)，正常植物細胞會及時啟動屬于可溶性蛋白的抗氧化系統(tǒng)，如SOD、POD和CAT的表達[19]。其中，POD和 SOD是作用于 O2-的抗氧化酶系統(tǒng)，突變體osyes1的劍葉、倒2葉和倒3葉的POD酶活極顯著低于野生型自選1號(圖4-E)，從而導(dǎo)致突變體葉片中的O2-含量極顯著增加(圖4-B)。而CAT是作用于H2O2的保護酶，野生型自選1號和突變體osyes1的劍葉、倒2葉和倒3葉之間的CAT酶活(圖4-D)均依次降低，但野生型僅倒3葉極顯著低于劍葉和倒2葉，造成野生型劍葉中的H2O2含量顯著增加(圖4-A)；而突變體所有葉片的CAT酶活(圖4-D)均極顯著低于野生型且依次極顯著降低，最終造成上 3葉中的H2O2極顯著增加。

葉片衰老既受環(huán)境以及病原微生物等外因的影響，也受植物內(nèi)源激素、ROS以及基因網(wǎng)絡(luò)的精細調(diào)控[18,23-25]。大量研究證實，WRKY和鋅脂蛋白轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子，在葉片衰老中起重要作用[26]。研究表明，抑制水稻鋅指蛋白基因OsDOS[27]或OsTZF1[28]的表達會引起水稻葉片早衰，而OsDOF24的功能獲得型突變體osdof24-D則表現(xiàn)為延緩衰老[29]。水稻 WRKY轉(zhuǎn)錄因子OsWRKY42[30]則可以與 OsMT1d的啟動子區(qū)域結(jié)合，進而抑制其表達并誘導(dǎo) ROS反應(yīng)，促進葉片衰老。此外，在擬南芥中過量表達RNA結(jié)合蛋白，如 StUBA2a/b、StUBA2c[31]以及 LARP1c[32]均導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因后代葉片衰老。在本研究的OsYES1基因的定位區(qū)間內(nèi)，尚沒有衰老相關(guān)的基因被定位或克隆，而與報道相關(guān)的導(dǎo)致水稻葉片衰老的基因分別為鋅指蛋白基因(LOC_Os07g17130和LOC_Os07g17400)和 RNA 結(jié)合蛋白基因(LOC_Os07g18050)。當(dāng)然，候選基因的最終確定要依賴于這些基因的測序分析及遺傳互補驗證。

謝辭：感謝浙江大學(xué)農(nóng)業(yè)試驗站提供的部分試驗場所。