蘭 梅，劉路宏，王 毅，王洪濤，張 雪，彭夢(mèng)露

（1.四川宜賓五糧液集團(tuán)公司質(zhì)量檢測(cè)中心，四川宜賓 644007；2.四川宜賓五糧液股份有限公司質(zhì)量管理部，四川宜賓 644007）

吖啶（Acridine）是一種由C、H 和N 元素構(gòu)成的雜環(huán)化合物，產(chǎn)自石油精餾過(guò)程[1]，具有低毒性，對(duì)皮膚和黏膜有強(qiáng)烈的刺激性，可螯合進(jìn)DNA 堿基對(duì)引起基因突變[2]。吖啶及其衍生物，常用作為染料和高級(jí)顏料[3]，從而廣泛使用于食品包裝材料生產(chǎn)制作和食品包裝的表面著色。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，安全與健康日益成為人們最為關(guān)注的焦點(diǎn)，而傳統(tǒng)的無(wú)機(jī)染料因其不可避免地會(huì)含有不同種類的重金屬成分[4]，在一定時(shí)期內(nèi)重金屬含量一直是食品行業(yè)監(jiān)控的重點(diǎn)，從而導(dǎo)致無(wú)機(jī)染料被食品周邊行業(yè)逐漸遺棄，取而代之的是不含任何重金屬成分的有機(jī)染料和有機(jī)顏料[5]，而吖啶則是有機(jī)染料和有機(jī)顏料中最為典型的代表[6]。酒精飲料是指乙醇體積分?jǐn)?shù)在0.5 %以上供人飲用的飲料，主要包含各種發(fā)酵酒、蒸餾酒、配制酒及預(yù)調(diào)酒[7]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，酒精飲料在餐桌上出現(xiàn)頻率也逐步升高，深受消費(fèi)者的喜愛。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明，2018 年度中國(guó)食品飲料市場(chǎng)酒精飲料占據(jù)96.4 %的份額[8]。因各種精美的酒精飲料包裝在生產(chǎn)過(guò)程中不可避免地會(huì)使用吖啶類有機(jī)染料和有機(jī)顏料，加之吖啶類物質(zhì)極易溶于乙醇等有機(jī)物中，從而會(huì)導(dǎo)致吖啶類物質(zhì)污染飲料本體且長(zhǎng)期穩(wěn)定存在，目前對(duì)酒精飲料中吖啶類物質(zhì)檢測(cè)還缺少有效的分析方法，故無(wú)法對(duì)其進(jìn)行有效的安全監(jiān)測(cè)。本研究采用高效液相色譜技術(shù)，建立了一種酒精飲料中吖啶含量的分析方法。該法樣品處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度較高，檢測(cè)投入較低，適合企業(yè)開展日常檢測(cè)項(xiàng)目。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

1.1.1 主要儀器

ThermoFisher 高效液相色譜儀（MultiMate 3000 標(biāo)準(zhǔn)四元系統(tǒng)，帶二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器，Chromeleon 7.0 數(shù)據(jù)處理軟件），美國(guó)ThermoFisher公司；QUINTIX224 型電子分析天平，德國(guó)SI Analytics 公司；INTEGRAL 3型純水機(jī)，美國(guó)Millipore公司。

1.1.2 材料與試劑

酒精飲料為采購(gòu)市售的黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒及白酒；甲醇為色譜級(jí)，德國(guó)Merck 公司；乙酸為ACS 級(jí)試劑，北京百靈威科技有限公司；乙醇為色譜級(jí)，德國(guó)Merck 公司；實(shí)驗(yàn)用水為超純水；吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，純度98%，上海阿拉丁試劑有限公司。

1.2 溶液配制

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

取等體積的超純水和乙醇混合，即為50 %v/v的乙醇水溶液。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液

準(zhǔn)確稱取吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.1020 g 于100 mL 容量瓶中，并加入適量甲醇，超聲溶解后用甲醇定容至100 mL，搖勻，即得含吖啶1000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)品中間溶液

取1.0 mL標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液于100 mL容量瓶中，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液定容至100 mL，即為含吖啶10 mg/L的中間液。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液將中間液逐級(jí)稀釋，配制成濃度 為1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)工作液。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 定性分析方法的研究

（1）準(zhǔn)確稱取吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度為98 %）0.1020 g 于100 mL 的容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即為1000 mg/L的吖啶溶液，將其轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中常溫避光保存。用甲醇將1000 mg/L的吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋至100 mg/L 和1.0 mg/L,置于棕色試劑瓶?jī)?nèi)，在4 ℃環(huán)境中保存。

（2）選擇美國(guó)ThermoFisher 的AcclaimTM 120-C18（4.6×250 mm，5 μm）反相色譜柱作為分離色譜柱，進(jìn)樣體積為20 μL，流動(dòng)相流速為1.0 mL/min，柱溫為35 ℃，采用等度洗脫的方法進(jìn)行洗脫，分別以不同體積比的甲醇水溶液作為流動(dòng)相，二極管陣列檢測(cè)器開啟紫外可見光燈，以190～800 nm 的掃描范圍進(jìn)行掃描，將100 mg/L 和1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣試驗(yàn)，以確定目標(biāo)化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)和適宜的流動(dòng)相比例。

（3）取目標(biāo)化合物的最大紫外吸收波長(zhǎng)N 作為激發(fā)波，以（N+20，650）為掃描區(qū)間，采用發(fā)射波掃描模式，將1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣試驗(yàn)，可以確定最佳發(fā)射波長(zhǎng)Em。確定Em 后，以Em 作為發(fā)射波長(zhǎng)，以（200，Em-20）作為激發(fā)波掃描區(qū)間，采用激發(fā)波掃描模式，將1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)樣試驗(yàn)，可以確定最佳激發(fā)波長(zhǎng)Ex。

（4）利用熒光檢測(cè)器，采用Ex 作為激發(fā)波長(zhǎng)，Em 作為發(fā)射波長(zhǎng)，進(jìn)樣量為20 μL，甲醇水為流動(dòng)相，采用控制變量法，分別確定最佳的柱溫、流通池溫度、流動(dòng)相比例等色譜條件。

1.3.2 定量分析方法

（1）檢出限和定量限的確定：取1.0 mg/L 的吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇稀釋至合適濃度的溶液后測(cè)定其信噪比，取3 倍信噪比作為檢出限（S/N=3），取10倍信噪比（S/N=10）作為定量限，計(jì)算該方法的檢出限和定量限。

（2）線性相關(guān)性的研究：取100 mg/L 的吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用體積分?jǐn)?shù)為50 %的乙醇溶液稀釋至1.0 mg/L 的中間濃度，然后再用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液稀釋至0.1 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L 的工作濃度，依次進(jìn)行RP-HPLC-FLD 分析，以目標(biāo)物的色譜峰積分面積（Y）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

（3）加標(biāo)回收率：分別以黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒和白酒陰性樣品作為空白基體，配制吖啶含量為1.0 μg/L、10.0 μg/L 和100.0 μg/L 的加標(biāo)樣品，將加標(biāo)樣品和空白基體均經(jīng)過(guò)0.22 μm 孔徑的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后進(jìn)入色譜儀進(jìn)行分析，采用外標(biāo)法計(jì)算目標(biāo)物的加標(biāo)回收率。

1.3.3 精密度試驗(yàn)

取100.0 mg/L的吖啶甲醇溶液，用50%vol的乙醇水溶液以及酒精飲料樣品逐級(jí)稀釋為10.0 μg/L，并分別對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行10 次獨(dú)立的重復(fù)試驗(yàn)，以考察方法的精密度。

1.3.4 樣品中目標(biāo)化合物含量的測(cè)定

將市售不同品牌的黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒和白酒經(jīng)0.22 μm 孔徑的有機(jī)系微孔濾膜過(guò)濾后，分別進(jìn)入色譜儀檢測(cè)以測(cè)定其中吖啶的濃度，同時(shí)對(duì)所有樣品配制濃度為1.0 μg/L 的加標(biāo)樣品，經(jīng)微孔過(guò)濾后進(jìn)入儀器分析，以作對(duì)比。

2 結(jié)果與討論

2.1 定性分析中色譜條件的確定

2.1.1 目標(biāo)化合物最大紫外可見吸收波長(zhǎng)的確定

吖啶分子中含有一個(gè)吡啶環(huán)和兩個(gè)苯環(huán)，在不同pH 值的溶液中可呈現(xiàn)綠色或藍(lán)色熒光，從而吖啶吡啶具有熒光特性[6，9]。研究表明，具有熒光特性的有機(jī)物在其熒光激發(fā)光波長(zhǎng)處均有紫外可見吸收特性。為確立吖啶的激發(fā)波長(zhǎng)需先獲取吖啶的紫外可見吸收光譜，當(dāng)采用體積比為60 %的甲醇水溶液作為流動(dòng)相分析吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)時(shí)，在40 min分析時(shí)間里僅出現(xiàn)1 個(gè)色譜峰，對(duì)于1.0 mg/L 和100.0 mg/L 的吖啶標(biāo)準(zhǔn)品，色譜峰面積大小有異，在不同體積比的甲醇水溶液作為流動(dòng)相時(shí)，該峰保留時(shí)間和峰型有變化，在甲醇體積比為80 %時(shí)峰型最佳，而對(duì)于空白對(duì)照（甲醇）在相同的保留時(shí)間內(nèi)未見任何色譜峰。基本可斷定此唯一色譜峰為吖啶，其在190～800 nm 范圍內(nèi)的紫外可見吸收光譜如圖1，從圖1 可見，吖啶在208.71 nm、248.15 nm和356.05 nm 處均有紫外吸收峰，其中最大吸收峰在248.15 nm處。

2.1.2 熒光波長(zhǎng)的選擇

分別用209 nm、248 nm 和356 nm 的紫外光作為激發(fā)光對(duì)吖啶進(jìn)行發(fā)射光譜掃描發(fā)現(xiàn)，248 nm和356 nm 的紫外光均能激發(fā)出吖啶的熒光，其中波長(zhǎng)為248 nm 的紫外光激發(fā)的熒光最為強(qiáng)烈，其發(fā)射光譜如圖2 所示。從圖2 可見，在248 nm 激發(fā)波長(zhǎng)下，吖啶的發(fā)射光波長(zhǎng)為光帶模式，位于330～550 nm 區(qū)間，其中強(qiáng)度最大的發(fā)射光波長(zhǎng)為446.68 nm。當(dāng)采用447 nm 作為發(fā)射波長(zhǎng)進(jìn)行激發(fā)波長(zhǎng)掃描時(shí)，其激發(fā)波光譜如圖3 所示。從圖3 可見，當(dāng)采取447 nm 作為發(fā)射光時(shí)，激發(fā)光譜呈現(xiàn)出雙峰，峰值波長(zhǎng)分別為248.15 nm 和355.19 nm，其中248.15 nm 處熒光強(qiáng)度高于355.19 nm 處。從而，作為激發(fā)光248 nm 優(yōu)于355 nm。有機(jī)物熒光強(qiáng)度受溫度影響，在溫度升高情況下其熒光強(qiáng)度會(huì)減弱，為獲得強(qiáng)度最強(qiáng)熒光，流通池溫度宜低不宜高，采用最低溫度45 ℃作為池溫。對(duì)于吖啶，熒光檢測(cè)器參數(shù)確定激發(fā)光波長(zhǎng)為248 nm，發(fā)射光波長(zhǎng)為447 nm，流通池溫度為45 ℃。經(jīng)試驗(yàn)證明，在樣品中，以上熒光檢測(cè)器條件依然可用，未發(fā)現(xiàn)有波長(zhǎng)漂移現(xiàn)象。

2.1.3 流動(dòng)相的優(yōu)化

吖啶生產(chǎn)過(guò)程中需要在甲醇中進(jìn)行重結(jié)晶從而獲得精品，因此采用甲醇作為有機(jī)相和標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的初始溶劑，而試驗(yàn)也證實(shí)采用甲醇作為流動(dòng)相比乙腈等其他有機(jī)溶劑能獲得更好的峰型和穩(wěn)定性。在酒精飲料中醇類物質(zhì)的含量最高可達(dá)96%，為確保酒精飲料中復(fù)雜的有機(jī)物群體不會(huì)頑固滯留于色譜柱中，故流動(dòng)相中有機(jī)相比例將70%作為下限。分別采用體積分?jǐn)?shù)為70%、75%、80%、85%、90 %的甲醇作為流動(dòng)相，進(jìn)樣量為20 μL，流速為1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為248 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為447 nm，流通池溫度為45 ℃，柱溫箱35 ℃分析100 μg/L的吖啶標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其色譜峰對(duì)比圖如圖4 所示。從圖4 可發(fā)現(xiàn)，當(dāng)甲醇比例為70 %時(shí)，目標(biāo)物出峰時(shí)間較晚且半峰寬較大，而隨著甲醇比例升高，峰寬變窄，峰高也增加，但當(dāng)甲醇比例為90 %時(shí)目標(biāo)物出現(xiàn)鬼峰，當(dāng)甲醇的體積比例為80%時(shí)目標(biāo)化合物色譜峰高最高，故最佳流動(dòng)相中甲醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，并采用等度洗脫。

2.1.4 色譜柱溫度的確定

色譜柱和流動(dòng)相確定后，分別考察了30 ℃、35 ℃、40 ℃和常溫（不定溫度）情況下的目標(biāo)化合物的色譜峰圖，保留時(shí)間隨溫度升高而縮短。當(dāng)采用不定溫度情況下，發(fā)現(xiàn)當(dāng)室溫波動(dòng)過(guò)大時(shí)，目標(biāo)物的保留時(shí)間有波動(dòng)，極限情況下影響峰識(shí)別。在4 個(gè)溫度條件下目標(biāo)物的響應(yīng)值沒(méi)有太大的變化，唯有保留時(shí)間有偏差，考慮到室溫平均水平和節(jié)能效果，采用35 ℃作為本方法的柱溫。

2.1.5 前處理?xiàng)l件的選擇

吖啶易溶于有機(jī)溶劑，在水中微溶，故針對(duì)酒精飲料樣品首先考慮過(guò)濾后直接進(jìn)樣。酒精飲料中乙醇含量一般為30%vol～70%vol，有機(jī)物含量較高，宜采用適用于有機(jī)物的有機(jī)系微孔濾膜。試驗(yàn)中分別采用了通用型的尼龍膜和PVDF 膜，分別處理不同乙醇含量的空白樣品和加標(biāo)樣品，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，尼龍膜和PVDF 膜對(duì)所有樣品的加標(biāo)回收影響不大，回收率均在95%～105%之間。因此選擇通用型的尼龍膜和有機(jī)系濾膜均可，本研究最終選擇PVDF膜。

2.1.6 色譜柱及色譜條件

采用色譜柱為AcclaimTM 120-C18（4.6×250 mm，5 μm）反相色譜柱；流動(dòng)相為甲醇∶水（80∶20 v/v）；流速為1.0 mL/min；熒光檢測(cè)器激發(fā)波長(zhǎng)為248 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為447 nm，流通池溫度為45 ℃；柱溫箱35 ℃。當(dāng)目標(biāo)化合物進(jìn)樣量為20 pg 時(shí)，其色譜峰圖如圖5 所示，理論塔板數(shù)為16424，峰高為3846463 counts，峰面積為436186 counts·min，半峰寬為0.103 min，拖尾因子Asm=1.23。樣品中吖啶色譜峰圖如圖5 所示，目標(biāo)峰與附近雜峰分離度均＞2，分離效果良好。

2.2 定量分析方法的研究

2.2.1 工作液標(biāo)準(zhǔn)品溶劑的選擇

吖啶純化時(shí)需在甲醇中進(jìn)行重結(jié)晶，故采用甲醇作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)存液的溶劑，實(shí)驗(yàn)證實(shí)標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1000 mg/L的甲醇溶液可長(zhǎng)時(shí)間保存。本方法目標(biāo)是用于酒精飲料檢測(cè)，酒精飲料中乙醇含量為0.5%vol～96%vol，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)基體中乙醇濃度對(duì)圖譜目標(biāo)化合物峰圖及響應(yīng)影響較小，采用折中濃度作為工作液的基體，故采用體積分?jǐn)?shù)為50 %的乙醇水溶液作為工作濃度標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋溶劑。

2.2.2 檢出限和定量限的探究

將1.0 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液用甲醇稀釋至0.1 μg/L 和0.01 μg/L 分別進(jìn)入液相色譜分析，發(fā)現(xiàn)0.01 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品未見明顯的色譜峰，0.1 μg/L 的標(biāo)準(zhǔn)品可見明顯色譜峰，且信噪比S/N=3.62，依據(jù)檢出限為3 倍信噪比（S/N=3）、定量限為10 倍信噪比（S/N=10）計(jì)算，可得本方法中吖啶的檢出限為0.083 μg/L，定量限為0.275 μg/L。

2.2.3 線性關(guān)系的考察

以50%vol乙醇水溶液作為基體，配制成濃度為0.1 μg/L、1.0 μg/L、10.0 μg/L、20.0 μg/L、50.0 μg/L、80.0 μg/L、100.0 μg/L 的工作溶液，依據(jù)本研究中建立的色譜條件和預(yù)處理方法進(jìn)行分析。以目標(biāo)化合物的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰的積分面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=43382X-2492.5，（R2=0.9999）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)工作液濃度高于150.0 μg/L 時(shí)，出現(xiàn)柱過(guò)載現(xiàn)象。以上結(jié)果表明，當(dāng)進(jìn)樣量為0.2 pg～2 μg，濃度為0.1～100.0 μg/L 時(shí)線性關(guān)系良好。同時(shí)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在進(jìn)樣量為0.2 pg～2 μg，濃度為0.1～100.0 μg/L 時(shí)目標(biāo)化合物濃度與色譜峰峰高也呈現(xiàn)線性關(guān)系，回歸方程為Y=391744x-64297（R2=0.9999）。從而在使用本方法是可任意選擇色譜峰峰高和色譜峰積分面積作為響應(yīng)值。

2.2.4 加標(biāo)回收率的測(cè)定

分別以黃酒、雞尾酒、啤酒、果酒以及白酒為樣品，配制高濃度（100.0 μg/L）、中濃度（10.0 μg/L）和低濃度（1.0 μg/L）加標(biāo)樣品，利用本研究開發(fā)的檢測(cè)方法檢測(cè)空白樣品和加標(biāo)樣品中吖啶的濃度，并計(jì)算目標(biāo)化合物的加標(biāo)回收率，結(jié)果見表1。從表1 中可見，在5 種酒精飲料中，低濃度（1.0 μg/L）的加標(biāo)回收率僅葡萄酒為47%，在50%～150%范圍之外，其余在此范圍內(nèi)，而中濃度和高濃度的加標(biāo)回收率良好，介于80%～110%之間。

表1 吖啶在5種酒精飲料中的回收率

2.2.5 精密度檢測(cè)

分別對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品工作液（濃度為10 μg/L）和加標(biāo)樣品（加標(biāo)濃度為10 μg/L）按照選定的色譜參數(shù)進(jìn)行10 次獨(dú)立的檢測(cè)試驗(yàn)，記錄目標(biāo)峰的峰面積和峰高，分別計(jì)算每個(gè)樣品峰面積和峰高的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。結(jié)果表明，色譜峰積分面積和峰高RSD(10)介于0.5～2.0 之間。試驗(yàn)結(jié)果表明，本方法進(jìn)樣方式和儀器精密度良好。

2.2.6 市售樣品測(cè)定

采用本研究開發(fā)的檢測(cè)方法分別對(duì)市售的18個(gè)不同品牌的酒精飲料進(jìn)行了吖啶含量的檢測(cè)，均未檢出目標(biāo)化合物，同時(shí)也同步進(jìn)行了樣品的加標(biāo)試驗(yàn)，在加標(biāo)樣品中均可準(zhǔn)確的檢測(cè)加標(biāo)物質(zhì)及加標(biāo)量，從而表明本方法適合進(jìn)行酒精飲料產(chǎn)品中吖啶含量的檢測(cè)。

3 結(jié)論

吖啶作為有機(jī)染料和有機(jī)顏料的重要成員，廣泛用于食品包裝。因其具備毒性和誘導(dǎo)基因突變的特性，食品經(jīng)源于包裝材料的吖啶污染后對(duì)人體健康存在一定的風(fēng)險(xiǎn)。本文建立了一種基于液相色譜法，利用熒光檢測(cè)器測(cè)定吖啶含量的方法，適用于酒精飲料中吖啶含量的測(cè)定。本法操作簡(jiǎn)單，無(wú)需復(fù)雜的前處理，準(zhǔn)確度和靈敏度較高，檢測(cè)投入較低，適合酒精飲料生產(chǎn)企業(yè)開展酒精飲料中吖啶含量的日常檢測(cè)。