古興波，胡小霞，左乾程，黃永光

（1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州貴陽(yáng) 550025；2.貴州大學(xué)貴州省發(fā)酵工程與生物制藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽(yáng) 550025）

白酒是以糧谷為主要原料，以大曲、小曲或麩曲及酒母等為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)蒸煮、糖化、發(fā)酵、蒸餾、貯存、勾兌而制成的飲料酒。中國(guó)白酒按香型劃分為：醬香型、濃香型、清香型等主要香型白酒，此外還有米香型、董香型、兼香型、鳳型、特型、豉香型、芝麻香型等，以及近年來(lái)發(fā)展興起的清醬香型白酒。造成各香型白酒酒體風(fēng)格差異的原因，除了與糖化發(fā)酵劑種類、發(fā)酵原料、自然環(huán)境和生產(chǎn)工藝等因素有關(guān)外，最根本的原因是發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)的不同，因此，研究白酒釀造體系微生物群落結(jié)構(gòu)，有助于認(rèn)識(shí)白酒發(fā)酵過(guò)程機(jī)理。

起初對(duì)釀酒微生物群落結(jié)構(gòu)的研究主要依賴于傳統(tǒng)的可培養(yǎng)技術(shù)手段。研究表明，自然界中99%以上的微生物不能培養(yǎng),使得可培養(yǎng)技術(shù)得到的研究結(jié)果存在一定的局限性。而宏基因組等技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用避開(kāi)了微生物分離純培養(yǎng)問(wèn)題,極大拓展了微生物資源的利用空間,增加獲得新活性物質(zhì)的機(jī)會(huì)和途徑。1985 年，PACE 等[1]首次提出可以通過(guò)直接從環(huán)境樣品中提取微生物的群體基因組DNA，繞過(guò)純培養(yǎng)技術(shù)直接對(duì)其進(jìn)行研究，并成功獲得了大量前所未知的微生物信息。1998年，Handelsman 等[2]提出了宏基因組學(xué)(metagenome)概念，并將其定義為：一種以環(huán)境樣品中的微生物群體基因組為研究對(duì)象，以功能基因篩選和測(cè)序分析為研究手段，以微生物多樣性、種群結(jié)構(gòu)、進(jìn)化關(guān)系、功能活性、相互協(xié)作關(guān)系及與環(huán)境之間的關(guān)系為研究目的的新的微生物研究方法，并第一次使用了Metagenomics 這個(gè)名詞。宏基因組學(xué)又稱元基因組學(xué)、環(huán)境(生態(tài))基因組學(xué)、群落基因組學(xué)，是一種不依賴于人工分離培養(yǎng)的微生物基因組技術(shù)。宏基因組技術(shù)的發(fā)展，為研究白酒釀造微生物多樣性提供了新的方法和手段,促進(jìn)了研究者對(duì)于釀酒微生物多樣性的認(rèn)識(shí)。本文在介紹宏基因組學(xué)技術(shù)的基礎(chǔ)上,分析其在白酒釀造領(lǐng)域中的研究及應(yīng)用情況,旨在為認(rèn)識(shí)白酒的發(fā)酵機(jī)理提供理論指導(dǎo)。

1 宏基因組學(xué)研究策略

宏基因組學(xué)研究的基本策略流程為：樣品和基因(組)的富集；提取特定環(huán)境中的基因組DNA或者RNA；構(gòu)建宏基因組文庫(kù)以篩選目的基因；目的基因活性產(chǎn)物表達(dá)。

1.1 環(huán)境樣品及目的基因組富集

對(duì)環(huán)境樣品的預(yù)富集可以提高目的基因的檢出幾率。目前，預(yù)富集技術(shù)主要分為細(xì)胞水平富集和基因組水平富集。其中，細(xì)胞水平富集主要是通過(guò)利用選擇培養(yǎng)基對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行富集培養(yǎng)，最常用的方法是底物選擇，此外還包括營(yíng)養(yǎng)選擇及物理化學(xué)指標(biāo)選擇。但是由于富集培養(yǎng)選擇性地富集了具有快速生長(zhǎng)特性的菌群，因此導(dǎo)致大部分物種多樣性信息丟失。目前可以通過(guò)先在嚴(yán)格脅迫條件下短期處理，然后改為較溫和的處理?xiàng)l件，可以在一定程度上克服這種方法的局限性?；蚪M水平富集常用的技術(shù)為穩(wěn)定同位素探針技術(shù)(SIP），此外，還有抑制性消減雜交技術(shù)、差異顯示技術(shù)、噬菌體展示技術(shù)、親和捕獲技術(shù)及DNA 微陣技術(shù)等[3]。

1.2 宏基因組DNA或者RNA的提取

DNA或者RNA的提取是宏基因組學(xué)用于微生物群落結(jié)構(gòu)研究的基礎(chǔ)，DNA 或RNA 提取的質(zhì)量決定了后續(xù)分析的質(zhì)量。對(duì)于不同類型的樣品采用不同的DNA 或者RNA 提取策略。Luna 等[4]在2006 年對(duì)海洋沉積樣品采用不同的DNA 提取策略來(lái)研究不同的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)深海微生物多樣性是否有影響，結(jié)果證明只采用單一的DNA 提取方法會(huì)極大地低估微生物多樣性。此外，對(duì)一些特殊的如烴和重金屬含量較高的土壤或者沉積樣品采用表面活性劑或者鰲合劑進(jìn)行潤(rùn)洗可以增加DNA 的得率[5]。

宏基因組DNA 或者RNA 的提取方法可分為直接提取法和間接提取法。直接提取法不需要將細(xì)胞從樣品中提取出來(lái)，所提取的DNA 似乎更能代表樣品的微生物群落，缺點(diǎn)是提取DNA 的同時(shí)也提取了樣品中的其他成分，有些成分會(huì)干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)。間接提取法是在裂解釋放DNA 之前，先將微生物細(xì)胞從它們的環(huán)境基質(zhì)中分離出來(lái)，這一方法的局限主要是很多細(xì)菌會(huì)吸附在樣品顆粒上不能被分離出來(lái)，結(jié)果將會(huì)導(dǎo)致所反映結(jié)果中微生物群落具有片面性[6]。因此，為了確定不同的微生物群落成員在其中可能起到的作用，所選擇的DNA提取方法除了要考慮樣品類型外，還要能夠?qū)⒂坞x于細(xì)胞外的DNA 以及己經(jīng)死亡的細(xì)胞的DNA 與具有活性的細(xì)胞的DNA 區(qū)分開(kāi)來(lái)。Nocker 和Camper[7]通過(guò)添加EMA 來(lái)去除環(huán)境樣品群落中的死亡細(xì)胞中的DNA。

1.3 宏基因組文庫(kù)的構(gòu)建

1.3.1 載體的選擇

載體選擇的原則主要考慮是否有利于目標(biāo)基因的擴(kuò)增和表達(dá)，以及在篩選細(xì)胞毒類物質(zhì)時(shí)表達(dá)量的調(diào)控等。根據(jù)克隆載體的不同，宏基因組文庫(kù)可分為質(zhì)粒文庫(kù)、細(xì)菌/酵母人工染色體文庫(kù)、噬菌體類載體文庫(kù)。早期宏基因組文庫(kù)主要以質(zhì)粒載體和大腸桿菌宿主細(xì)胞構(gòu)建而成的小片段(＜15 kb)文庫(kù)。該文庫(kù)操作簡(jiǎn)便、拷貝數(shù)高、對(duì)DNA 質(zhì)量要求不高，適合純度低或剪切較嚴(yán)重的DNA 模版。但插入片段小，篩選量大，活性比率低，主要適用于分析新的基因序列信息及篩選編碼代謝相關(guān)的單一基因或小操縱子。Fosmid 文庫(kù)和Cosmid 文庫(kù)能容納15～40 kb 的外源DNA，同時(shí)己經(jīng)成功構(gòu)建了容量高達(dá)200～350 kb 外源DNA 的細(xì)菌人工染色體文庫(kù)和酵母人工染色體文庫(kù)。該文庫(kù)不僅擁有巨大的插入片段載量，而且穩(wěn)定性好、篩選效率高、克隆表達(dá)能力強(qiáng)，可獲得基因簇表達(dá)活性物質(zhì)。主要用于分析某一生境中微生物群落多樣性及篩選由基因簇或多個(gè)基因控制表達(dá)的活性物質(zhì)。但其操作較復(fù)雜繁瑣、對(duì)DNA 純度要求較高，且拷貝數(shù)低，擴(kuò)增較困難。此外，λ-噬菌體和其他病毒也可以作為構(gòu)建宏基因組克隆文庫(kù)的載體[3]。

1.3.2 宿主細(xì)胞的選擇

宿主菌株的選擇主要考慮轉(zhuǎn)化效率、重組載體在宿主細(xì)胞中的穩(wěn)定性、宏基因的表達(dá)、目標(biāo)性狀(如抗菌)缺陷型等因素。E.coli操作簡(jiǎn)單、繁殖迅速、培養(yǎng)代謝易于控制，是最常用的宿主細(xì)胞。但是由于環(huán)境樣品的總DNA 有很大一部分為真核基因組DNA，其在細(xì)菌宿主中往往不能表達(dá)，大大限制了這部分基因的篩選。也有報(bào)道利用鏈霉菌、假單胞菌等真菌作為受體來(lái)鑒定有關(guān)新抗生素生物合成的基因，但技術(shù)還不成熟。

1.4 宏基因組文庫(kù)篩選

1.4.1 序列依賴性篩選法

序列依賴性篩選法是根據(jù)文庫(kù)中的己知序列或保守序列來(lái)設(shè)計(jì)雜交探針或PCR引物，從宏基因組文庫(kù)中篩選目標(biāo)序列。功能基因PCR 擴(kuò)增技術(shù)是最為常用的序列依賴性篩選法。此外，還有微序列技術(shù)(Microarray，又稱基因芯片)和焦磷酸測(cè)序(Pyrosequencing)技術(shù)等。序列分析法需要根據(jù)已知的基因和基因表達(dá)產(chǎn)物的保守序列設(shè)計(jì)引物和探針，因此，對(duì)鑒定新的基因成員有一定的局限性，且PCR 往往只能獲得部分基因的擴(kuò)增。2014 年，劉小樂(lè)等[8]開(kāi)發(fā)出一種統(tǒng)計(jì)方法，被稱為基于模型的全基因組CRISPR/Cas9 敲除分析（MAGeCK），來(lái)確定來(lái)自于CRISPR/Cas9 篩選的必需sgRNA、基因和通路。Margulies[9]等描述了一個(gè)可擴(kuò)展，高度并行的測(cè)序系統(tǒng)microfabricated high-density picolitre reactors，原始吞吐量顯著大于最先進(jìn)的毛細(xì)管電泳儀器。能夠在4 h 運(yùn)行中以99 %或更好的精確度測(cè)序2500 萬(wàn)個(gè)堿基，并開(kāi)發(fā)了用于DNA 擴(kuò)增的乳液方法和用于使用針對(duì)固體支持物和皮升級(jí)體積優(yōu)化的焦磷酸測(cè)序方案的通過(guò)合成測(cè)序的儀器。通過(guò)鳥槍測(cè)序和從頭組裝的支原體生殖基因組展示這個(gè)系統(tǒng)的效用，吞吐量、準(zhǔn)確性和魯棒性，96%的覆蓋率在99.96%的精度在一臺(tái)機(jī)器的運(yùn)行。由CRISPR/Cas9 技術(shù)與單指導(dǎo)RNA（sgRNA）庫(kù)介導(dǎo)的陣列遺傳篩選需要高通量平臺(tái)，能夠在全基因組規(guī)模高效率地轉(zhuǎn)染不同的細(xì)胞類型，用于檢測(cè)和分析復(fù)雜的細(xì)胞表型。Bian 等[10]開(kāi)發(fā)了高通量原位細(xì)胞電穿孔（HiCEP）微系統(tǒng)。成功地將編碼增強(qiáng)的綠色和紅色熒光蛋白（EGFP 和ERFP）的兩種質(zhì)粒在169 微孔陣列芯片上電穿孔連接到附著的HeLa細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率為71.6%±11.4%和62.9%±2.7%，細(xì)胞存活率高于95%。并成功地將sgRNA選擇性電穿孔到以高通量方式表達(dá)Cas9 核酸酶的293T 細(xì)胞中，觀察到由于修復(fù)由CRISPR/ Cas9 系統(tǒng)介導(dǎo)的蛋白質(zhì)編碼序列而導(dǎo)致的GFP 強(qiáng)度增加4 倍。這項(xiàng)研究證明，這種HiCEP 系統(tǒng)在將來(lái)用于難轉(zhuǎn)染細(xì)胞上的全基因組CRISPR 文庫(kù)的陣列功能篩選中具有巨大的潛力。

1.4.2 非序列依賴性篩選法

非序列依賴性篩選法，其不依賴于任何己知序列信息，僅根據(jù)文庫(kù)克隆子產(chǎn)生的活性物質(zhì)進(jìn)行篩選。其中，以功能篩選法最為常用，此外還有底物誘導(dǎo)基因表達(dá)(SIGEX)法、穩(wěn)定性同位素技術(shù)篩選法、熒光原位雜交技術(shù)篩選法、基因陷阱技術(shù)等。

1.5 宏基因組數(shù)據(jù)分析

目前，針對(duì)微生物群落高通量測(cè)序數(shù)據(jù)分析的軟件主要有Mothur、MEGAN、Qiime、JCoast 以及STAMP。2012 年，李昂[11]開(kāi)發(fā)了基于Linux 平臺(tái)的宏基因組分析軟件MINT。2015 年,李俊鋒[12]開(kāi)發(fā)了一套完整的16S r RNA 基因測(cè)序數(shù)據(jù)處理流程關(guān)于宏基因組測(cè)序數(shù)據(jù)，為僅考慮物種分類和豐度信息的情況建立了一套高效率、高一致性的數(shù)據(jù)處理流程。2015年，美國(guó)Los Alamos國(guó)家實(shí)驗(yàn)室的科學(xué)家們向人們展示了一套宏基因組分析的新工具-GOTTCHA(Genomic Origins Through Taxonomic CHAllenge)。這一工具能在核酸數(shù)據(jù)中尋找符合要求的獨(dú)特序列，可以對(duì)鳥槍法宏基因組學(xué)數(shù)據(jù)進(jìn)行非常精確的分類，在復(fù)雜樣本中進(jìn)行物種鑒定和相對(duì)豐度分析，能夠同時(shí)鑒定細(xì)菌和病毒序列。GOTTCHA 也被成功用于難以處理的環(huán)境和臨床樣本，表現(xiàn)出超越其他現(xiàn)有方法的卓越性能[13]。2017年，有研究者在Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq 生物信息學(xué)分析的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)和現(xiàn)有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNAseq數(shù)據(jù)分析指南。這份指南覆蓋了RNA-seq數(shù)據(jù)分析的所有主要步驟，比如質(zhì)量控制、讀段比對(duì)、基因和轉(zhuǎn)錄本定量、差異性基因表達(dá)、功能分析、基因融合檢測(cè)、eQTL 圖譜分析等等。此外，他們還介紹了RNA-seq 數(shù)據(jù)與其他數(shù)據(jù)類型的整合。這種數(shù)據(jù)整合可以將基因表達(dá)調(diào)控與分子生理學(xué)和功能基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來(lái)，如今越來(lái)越受到研究者的歡迎。

2 宏基因組學(xué)在白酒行業(yè)中的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用

2.1 宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于發(fā)掘白酒微生物資源

2.1.1 宏基因組技術(shù)克隆分離功能基因

從環(huán)境中提取高質(zhì)量DNA，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，從中篩選到功能基因或基因簇，展示宏基因組技術(shù)從環(huán)境中克隆任何生物體基因的可能性。通過(guò)構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，從中鑒定出的大多數(shù)基因都是新的基因。宏基因組技術(shù)可以應(yīng)用于微生物基因資源的“生物探礦”。利用宏基因組文庫(kù)，已發(fā)現(xiàn)的新基因主要有：生物催化劑基因、抗生素抗性基因以及編碼轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因等。如纖維素酶基因、分解脂肪的基因、分解淀粉的基因、甲烷單加氧酶基因、紅曲霉功能基因等。

2.1.2 宏基因組技術(shù)篩選有價(jià)值的功能酶

近年來(lái)，宏基因組學(xué)技術(shù)對(duì)生物催化劑——新酶的篩選發(fā)現(xiàn)層出不窮。與大曲酒生產(chǎn)有關(guān)的酶類如淀粉酶、蛋白酶、氧化還原酶、脂肪酶、酯酶等新功能酶（詳見(jiàn)表1），并可能獲得新酶的特征信息。特別是對(duì)于未培養(yǎng)微生物產(chǎn)生的酶類，通過(guò)宏基因組技術(shù)從環(huán)境中篩選分離得出，加以研究應(yīng)用。大曲酒的固態(tài)發(fā)酵酒醅中含有多種微生物產(chǎn)生的多酶體系，一方面將原料中蛋白質(zhì)、糖類、脂肪等大分子物質(zhì)逐漸分解，供自身代謝作用；另一方面為乙醇和香味組分提供前體物質(zhì)，或參與重要香味組分物質(zhì)的形成。但是，目前對(duì)大曲酒發(fā)酵的功能酶和酶系的深入研究還是太少。因此，借助宏基因組技術(shù)分離純化大曲酒微生物分泌的功能酶，發(fā)現(xiàn)大曲酒生產(chǎn)用微生物的新的功能酶類，以利用這些酶類在大曲酒釀造過(guò)程發(fā)揮應(yīng)有的作用[14]。

表1 已構(gòu)建的宏基因組文庫(kù)及其篩選到的活性克隆

2.1.3 宏基因組技術(shù)選育微生物功能菌

生絲微菌是一類以甲醇作為唯一碳源和能源，通過(guò)出芽過(guò)程繁殖的柄細(xì)菌。該菌的生理特性使其難分離培養(yǎng)。吳衍庸等從酒窖環(huán)境中分離出生絲微菌(Hyphomacrobaum)的1 株純培養(yǎng)菌株，由于該菌具有生長(zhǎng)消耗甲醇的生理特征，在老窖中的發(fā)現(xiàn)和分離，有可能對(duì)老窖發(fā)酵生產(chǎn)出的大曲酒所含的甲醇進(jìn)行有效的調(diào)控。宏基因組技術(shù)不必經(jīng)過(guò)純培養(yǎng)的分離方法，也可以尋找甲醇生物降解的功能菌。Radajewski 等利用13C 標(biāo)記甲醇投加到橡樹林的土壤，富集一段時(shí)間，提取土壤總DNA，建立宏基因組文庫(kù)，篩選出13C 標(biāo)記的DNA，經(jīng)16S rRNA 擴(kuò)增后，鑒定出一些微生物是可以利用甲醇做為碳源的微生物種群。

從大曲微生物、窖泥微生物以及生產(chǎn)現(xiàn)場(chǎng)環(huán)境微生物構(gòu)成糟醅釀造微生物區(qū)系，通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)品體現(xiàn)窖池主要功能菌的存在狀態(tài)。通過(guò)分離宏基因組文庫(kù)的基因，根據(jù)該基因?qū)ふ蚁鄳?yīng)的微生物功能菌，可以達(dá)到認(rèn)識(shí)功能菌效用和發(fā)揮其作用的目的。宏基因組學(xué)技術(shù)根據(jù)編碼基因?qū)ふ倚挛⑸锏呐囵B(yǎng)條件，為微生物純培養(yǎng)技術(shù)提供可供選擇的培養(yǎng)基資源。如用4-羥基丁酸作唯一的碳源和能源篩選到了5 個(gè)能夠穩(wěn)定利用4-羥基丁酸的克隆子。經(jīng)分析，這些克隆子具有4-羥基丁酸脫氫酶活性，據(jù)此可以利用該基因編碼的活性物質(zhì)4-羥基丁酸作唯一的碳源，開(kāi)展實(shí)驗(yàn)室純培養(yǎng)。該方法主要是基于活性篩選技術(shù)的特殊條件——選擇性培養(yǎng)基，可以打破宏基因組技術(shù)對(duì)微生物功能菌的“可知不可求”的局面，它為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)編碼新基因的微生物提供了一條新途徑。所以，大曲酒的未培養(yǎng)微生物功能菌的獲得，可以借助根據(jù)宏基因組文庫(kù)提供的線索，通過(guò)新的培養(yǎng)方法，獲得具有重要生態(tài)功能的新的功能菌或未培養(yǎng)微生物的功能菌[14]。

2.2 宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于白酒微生物多樣性研究

2.2.1 宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于濃香型白酒微生物多樣性研究

（1）窖泥微生物的研究

中國(guó)濃香型白酒在工藝上與其他三大香型白酒最大的區(qū)別在于采用泥窖發(fā)酵，窖泥對(duì)于濃香型白酒“窖香濃郁，綿甜醇厚”風(fēng)格的形成具有不可替代的作用。探索中國(guó)濃香型白酒窖池窖泥中微生物群落構(gòu)成及其系統(tǒng)發(fā)育對(duì)濃香型白酒生產(chǎn)及品質(zhì)監(jiān)控具有重要的指導(dǎo)意義。

董雅舒[15]應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)濃香型白酒窖池細(xì)菌菌群進(jìn)行了分析，測(cè)定了5 種樣品中的細(xì)菌菌群的組成，并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹，得出濃香型窖池微生物具有明顯的多樣性。王福禎通過(guò)454焦磷酸測(cè)序法，對(duì)8 個(gè)濃香型窖泥樣本中原核和真核微生物進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)原核微生物分屬于18個(gè)門，213 個(gè)屬，細(xì)菌總OTUs 有1183 個(gè)。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)真核微生物群落分屬于5 個(gè)門，9 個(gè)綱，10 個(gè)目，13 個(gè)科，18 個(gè)屬，真菌總OTU 種類為64 個(gè)。王莉等[16]以細(xì)菌16S rDNA 的V6 區(qū)為對(duì)象，采用Illamina高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行深度測(cè)序技術(shù)，對(duì)比分析了醬香型窖底泥與土壤微生物的差異。共獲得14156條高質(zhì)量的V6 區(qū)標(biāo)簽序，聚類分析共產(chǎn)生1801 條OTU 序列，其中土壤樣本680 條，使用1 個(gè)月的窖底泥樣本629 條，使用12 個(gè)月的窖底泥樣本492條。向文良等人利用PBS 緩沖液富集窖池酒醅中的微生物菌體，研究窖池中微生物區(qū)系分布及相互關(guān)系。在分子分類水平上，運(yùn)用PCR 擴(kuò)增技術(shù)和16S rDNA 序列同源性分析等方法測(cè)定窖池中原核微生物的16S rRNA 基因全序列，根據(jù)與基因數(shù)據(jù)庫(kù)中相似菌群16S rDNA 序列的同源性比較建立系統(tǒng)發(fā)育樹圖。

Ding 等[17]通過(guò)nested PCR-DGGE 研究中國(guó)濃香型白酒的窖泥中的真菌和古菌群落多樣性，比較了取自窖池四壁（CW）和窖池底部（Cb）的窖泥真細(xì)菌和古細(xì)菌的微生物群落結(jié)構(gòu)。此外，鄧杰、黃治國(guó)等[18-21]研究了窖池古菌群落結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，以及不同窖齡窖池窖泥中古菌群落結(jié)構(gòu)；何翠容等[22]研究了濃香型白酒窖池細(xì)菌與古菌隨窖齡變化的特征；羅杰等[23]研究了濃香型白酒窖池窖泥中原核微生物菌群；于春濤[24-25]等分析了不同產(chǎn)區(qū)濃香型白酒窖泥中細(xì)菌多樣性和窖泥變質(zhì)前后古菌群落差異；施思[26]研究了不同窖泥的微生物群落特征；湯斌[27]研究了窖泥中細(xì)菌多樣性的免培養(yǎng)技術(shù)；王濤等[28]研究了宜賓濃香型白酒窖泥中細(xì)菌的系統(tǒng)發(fā)育多樣性；劉茂柯等[29]研究了窖泥古菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性；陳衛(wèi)東從微觀角度論述了窖泥微生境的形成，闡述了環(huán)境因子、微生境分化及界面微生物細(xì)胞間的關(guān)系。唐玉明等對(duì)滬州老窖老窖池窖泥特性進(jìn)行了系統(tǒng)分析，剖析了窖泥中各種理化成分的組成及新、老窖泥的特性差異。張麗鶯從環(huán)境因子、微生物區(qū)系及香氣成分三方面探討了窖池微生態(tài)在發(fā)酵過(guò)程中的變化情況，并據(jù)此建立了窖池微生態(tài)信息管理庫(kù)軟件。羅海、劉森等人對(duì)窖池不同空間位置窖泥所處的環(huán)境因子進(jìn)行監(jiān)測(cè)，分析了窖池發(fā)酵過(guò)程中不同空間位置和不同發(fā)酵時(shí)間糟醅的環(huán)境因子伴隨微生物活動(dòng)而發(fā)生的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。

（2）酒曲微生物的研究

傳統(tǒng)固態(tài)發(fā)酵白酒酒曲采用開(kāi)放式生產(chǎn)，白酒微生物種類繁多，群系復(fù)雜，采用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法研究，會(huì)遺漏很多微生物種類，甚至可能是關(guān)鍵性功能微生物。隨著現(xiàn)代生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)酒曲的研究也越來(lái)越多。

葉光斌應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)解析濃香型大曲發(fā)酵儲(chǔ)藏過(guò)程以及真菌群落的演替規(guī)律，結(jié)果表明，大曲真菌微生物復(fù)雜多樣，發(fā)酵環(huán)境以及真菌間的協(xié)調(diào)作用都對(duì)真菌的群落組成產(chǎn)生影響。王世寬對(duì)PCR-DGGE 用于濃香型大曲微生物群落分析的條件進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，細(xì)菌DGGE 電泳最佳變性劑濃度梯度為35 %～55 %，真菌的最佳濃度為30%～50%，運(yùn)用優(yōu)化后的條件進(jìn)行測(cè)定，得出較豐富的微生物群落。李家民用DGGE 方法初步分析了濃香型大曲微生物真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，曲內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)因大曲部位的不同而有所差異。PCR-SSCP(單鏈構(gòu)象多態(tài)性)技術(shù)是通過(guò)DNA 構(gòu)象差別來(lái)檢測(cè)點(diǎn)突變的方法。長(zhǎng)度相同堿基序列不同的單鏈DNA 構(gòu)象不同，形成了單鏈構(gòu)象多態(tài)性，因而也適合分析微生物的多樣性，如羅惠波[30]用該法解析了濃香型大曲原核、真核微生物群落，結(jié)果表明，發(fā)酵各時(shí)期曲樣的群落結(jié)構(gòu)相似，同時(shí)也具有多態(tài)性；不同微生物群落具有協(xié)同和制約的復(fù)雜生態(tài)學(xué)效應(yīng)；各時(shí)期曲樣微生物多樣性指數(shù)均在1.69～2.01 之間，群落結(jié)構(gòu)相對(duì)較穩(wěn)定；各曲樣微生物群落相似性位于0.67～1.00 之間，鄰近時(shí)期樣品間的相似性程度較高；主要優(yōu)勢(shì)真菌的菌群變化及生物學(xué)特征說(shuō)明其代謝活動(dòng)與濃香型白酒糟醅發(fā)酵中大分子物質(zhì)的降解及白酒風(fēng)味物質(zhì)的形成密切相關(guān)。李家民等用DGGE 分析濃香型大曲時(shí)發(fā)現(xiàn)電泳圖中大曲真菌的條帶可多達(dá)21種，進(jìn)一步對(duì)優(yōu)勢(shì)菌條帶鑒定為根霉(Rhizopussp.SAUFS3-1)、有孢圓酵母(Torulasporasp.SG5S08)和絲衣霉?fàn)罨@狀菌(Talaromyces yssochlamydoides)。葉光斌等用PCR-DGGE 條帶多樣品性及變化規(guī)律分析發(fā)現(xiàn)濃香型大曲發(fā)酵、儲(chǔ)藏過(guò)程中真菌多樣性演替規(guī)律。劉孟華[31]以劍南春酒曲為研究對(duì)象，采用宏基因組學(xué)方法提取總基因組DNA，經(jīng)PCR 擴(kuò)增16S rDNA V4 區(qū)構(gòu)建文庫(kù)并測(cè)序，進(jìn)行劍南春酒曲中細(xì)菌群落多樣性的研究。結(jié)果表明，劍南春酒曲微生物群落構(gòu)成較穩(wěn)定，主要分布在Proteobacteria、Firmicutes、Actinobacteria 三大門中，占總量的95%以上。

（3）酒醅微生物的研究

Sun 等[32]通過(guò)Illumina Miseq 測(cè)序分析不同季節(jié)的中國(guó)濃香型白酒生產(chǎn)中的細(xì)菌多樣性，揭示了先前在糟醅中未鑒定的放線菌綱、普雷沃氏菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬和葡萄糖醋桿菌。且結(jié)果證實(shí)，釀造季節(jié)對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的形成有關(guān)鍵影響。不同的釀造季節(jié)對(duì)發(fā)酵溫度和環(huán)境水分起到?jīng)Q定性作用，影響微生物的生長(zhǎng)和死亡，改變細(xì)菌群落的數(shù)量，并在糟醅中形成獨(dú)特的細(xì)菌組成。向文良等利用16S RNA分析手段，對(duì)窖池糟醅中的微生物群落的區(qū)系分析及相互關(guān)系進(jìn)行研究。張文學(xué)、喬宗偉等[33-36]對(duì)濃香型白酒窖池酒醅中細(xì)菌菌群、真菌菌群、微生物區(qū)系進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析。馮治平[37]采用PCRSSCP 技術(shù)研究了濃香型白酒酒醅發(fā)酵過(guò)程中古菌群落的變化規(guī)律，結(jié)果發(fā)現(xiàn)古菌群落在發(fā)酵過(guò)程中的變化較小。

2.2.2 宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于醬香型白酒微生物多樣性研究

譚映月等應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)分析醬香型白酒酒曲微生物多樣性，得出醬香型白酒微生物群落組成存在明顯差異。袁帥[38]以茅臺(tái)、國(guó)臺(tái)第4 次蒸餾前的酒糟為研究對(duì)象，對(duì)醬香型酒糟中細(xì)菌多樣性進(jìn)行研究，構(gòu)建16S rDNA V4 區(qū)文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序分析，分別讀出6755 和6738 個(gè)OTUs,主要分屬11個(gè)門。

2.2.3 宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于清香型白酒微生物多樣性研究

蘭玉倩等應(yīng)用PCR-DGGE 指紋技術(shù)分析了清香大曲酵母群落結(jié)構(gòu)，得出在大曲生產(chǎn)過(guò)程中有7種主要的真菌。王海燕應(yīng)用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)清香型汾酒微生物群落結(jié)構(gòu)演替進(jìn)行了研究。Zheng等[39]通過(guò)可培養(yǎng)和未培養(yǎng)方法研究了汾酒大曲中的微生物多樣性?；谄?6S rDNA（細(xì)菌）、26S rDNA 和ITS 區(qū)（真菌）的序列，分離并鑒定了總共190 個(gè)微生物菌株，包括109 個(gè)細(xì)菌和81 個(gè)酵母菌和霉菌。喬曉梅[40]等利用高通量測(cè)序法分析了冷季和熱季清香型白酒生產(chǎn)用曲真菌群落結(jié)構(gòu)，結(jié)果共比對(duì)出90種真核生物。

2.2.4 宏基因組學(xué)技術(shù)應(yīng)用于其他香型白酒微生物多樣性研究

李德林等用PCR-DGGE 技術(shù)對(duì)白酒酒醅微生物群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。結(jié)果表明，酒醅中微生物有18 個(gè)屬。高亦豹等利用PCR-DGGE 未培養(yǎng)技術(shù)，對(duì)中國(guó)白酒5 種高溫大曲和中溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)分析，鑒定了大曲中細(xì)菌菌落信息。司波等對(duì)PCR-DGGE 技術(shù)在微生物群落研究方面的優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行了分析，并著重就其應(yīng)用進(jìn)行了闡述。孟鎮(zhèn)等用PCR-DGGE 電泳條帶分析中國(guó)白酒大曲中細(xì)菌多樣性，并沒(méi)有鑒定出微生物的具體組成。羅惠波等[30]和高亦豹等人利用PCR-DGGE 技術(shù)分析中高溫大曲細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。喬宗偉等以常規(guī)的菌落分離培養(yǎng)及分類鑒定方法為主，以16S rDNA、18S rDNA序列分析為補(bǔ)充對(duì)全興酒廠酒醅微生物區(qū)系進(jìn)行了分析。張晶[41]運(yùn)用PCR-DGGE 技術(shù)研究了稻花香大曲微生物的群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。衛(wèi)春會(huì)[42]研究了窖泥微生物群落SSCP 分析條件優(yōu)化。

2.3 宏基因組技術(shù)應(yīng)用于白酒香味組分物質(zhì)的研究

中國(guó)傳統(tǒng)大曲酒是世界上香味成分最為豐富的蒸餾酒。包括乙醇、高級(jí)醇、有機(jī)酸、酯、內(nèi)酯、羰基化合物、芳香化合物、含氮化合物、含硫化合物等。據(jù)研究，茅臺(tái)酒有936 個(gè)色譜峰，濃香型酒有674 個(gè)色譜峰，清香型酒有486 個(gè)色譜峰。這些復(fù)雜的香味物質(zhì)來(lái)自大曲酒的生產(chǎn)原料、特殊的釀造工藝及眾多微生物的發(fā)酵代謝產(chǎn)生。宏基因組技術(shù)為揭示大曲酒的酒香奧秘開(kāi)辟出新天地。通過(guò)宏基因組篩選可以得到微生物代謝合成的有價(jià)值的化合物。新的化合物的篩選在一定條件下，先測(cè)定不同結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在色譜中呈現(xiàn)不同的峰值，與宏基因組的基因片段轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖參照，來(lái)篩選產(chǎn)生新的化合物克隆子。如Courtois 等構(gòu)建了土壤穿梭粘粒載體文庫(kù)，篩選出5000 個(gè)克隆，從中發(fā)現(xiàn)了11個(gè)新的聚酮合酶1(PKSI)的基因，采用HPLC 技術(shù)發(fā)現(xiàn)了脂肪二烯醇中2 種互為同分異構(gòu)體的新化合物。Wang 等在篩選以鏈霉菌為宿主構(gòu)建的宏基因組文庫(kù)中，從1020 個(gè)克隆子中發(fā)現(xiàn)2 個(gè)產(chǎn)生新結(jié)構(gòu)化合物的克隆子，進(jìn)一步純化分析獲得了A-E5種新的小分子抗菌化合物。

因此，運(yùn)用宏基因組技術(shù)構(gòu)建大曲酒微生物的宏基因文庫(kù)，通過(guò)特定篩選方法發(fā)現(xiàn)新的化合物來(lái)揭示大曲酒的香味物質(zhì)的未知組分。崔利等對(duì)醬香型大曲酒含有眾多的香味物質(zhì)吡嗪化合物提出一個(gè)推斷：在高溫制曲、高溫堆積環(huán)節(jié)、高溫發(fā)酵過(guò)程所產(chǎn)生的吡嗪化合物，除了酶和非酶參與的褐變反應(yīng)外，應(yīng)該說(shuō)有相當(dāng)部分是微生物代謝產(chǎn)物，因?yàn)檫@3 個(gè)階段中都有能夠產(chǎn)生吡嗪化合物的大量枯草桿菌。對(duì)此推斷，可以通過(guò)宏基因組技術(shù)通過(guò)試驗(yàn)加以驗(yàn)證。在高溫制曲、高溫堆積環(huán)節(jié)、高溫發(fā)酵3 階段，宏基因組技術(shù)提取環(huán)境微生物DNA，構(gòu)建宏基因組文庫(kù)，通過(guò)測(cè)定吡嗪化合物的色譜峰，參照宏基因組的基因片段轉(zhuǎn)入和未轉(zhuǎn)入外源基因的宿主細(xì)胞或發(fā)酵液抽提物的色譜圖，來(lái)篩選能夠產(chǎn)生吡嗪化合物的克隆子，通過(guò)基因測(cè)序分析和16S rRNA 擴(kuò)增鑒定，有可能找出產(chǎn)生吡嗪化合物的 那一 種 微生 物[3]。Wang 等[43]進(jìn)行 基 于PCR 的 變性梯度凝膠電泳（DGGE）和16S rRNA 基因文庫(kù)分析，分析兩種不同原料發(fā)酵的中國(guó)酒的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，強(qiáng)香味發(fā)酵谷物中的主要細(xì)菌是來(lái)自類芽孢桿菌，擬桿菌屬和梭菌的主要細(xì)菌，而焙烤芝麻香味發(fā)酵谷物中的主要細(xì)菌屬于芽孢桿菌，黃桿菌和丙酮桿菌。液體發(fā)酵的細(xì)菌多樣性的分子分析將有益于在液體香料成分的形成中起關(guān)鍵作用的重要微生物的分析。Li 等[44]使用克隆庫(kù)和焦磷酸測(cè)序法研究了清香型酒汾酒的細(xì)菌和真菌群落多樣性。通常，只有幾種類型的細(xì)菌和真菌是有助于白酒發(fā)酵過(guò)程的主要微生物。我們的研究結(jié)果表明，更多不同的細(xì)菌和真菌物種聯(lián)合的作用貢獻(xiàn)了汾酒在不同時(shí)期的發(fā)酵過(guò)程。這項(xiàng)研究提供的證據(jù)表明，添加一種或多種細(xì)菌和真菌物種可以改善傳統(tǒng)或工業(yè)酵母菌株發(fā)酵中酒的質(zhì)量。此外，在不同時(shí)間段有助于發(fā)酵過(guò)程的細(xì)菌和真菌物種的知識(shí)可能有助于控制酒的生產(chǎn)系統(tǒng)和提高酒的質(zhì)量。另一方面，潛在地篡改汾酒質(zhì)量的細(xì)菌和真菌物種應(yīng)該受到更多的關(guān)注和進(jìn)一步的研究。關(guān)于對(duì)化學(xué)和物理性質(zhì)與主要微生物之間的相關(guān)性，以及有助于發(fā)酵過(guò)程細(xì)菌和真菌的假設(shè)類型，進(jìn)行更詳細(xì)檢驗(yàn)的進(jìn)一步研究是必要的。

3 結(jié)束語(yǔ)

宏基因組學(xué)在白酒行業(yè)中的研究主要集中在微生物多樣性研究方面，其中關(guān)于濃香型白酒的研究很多，醬香型、清香型和其他香型白酒的研究相對(duì)少一點(diǎn)。此外，宏基因組學(xué)在白酒微生物資源發(fā)掘和白酒香味組分的研究方面，也起了很大的推動(dòng)作用。對(duì)白酒釀造微生物的研究，多年來(lái)一直是行業(yè)熱點(diǎn)，但對(duì)微生物群落作為整體的性能認(rèn)識(shí)是不足或片面的，特別是微生物菌群和多酶體系的認(rèn)識(shí)缺乏，影響我們對(duì)白酒微生物菌落代謝機(jī)理的系統(tǒng)全面的認(rèn)識(shí)。另外，缺乏系統(tǒng)性的研究。比如醬香型白酒1 輪次到7 輪次的微生物區(qū)系，發(fā)酵過(guò)程中微生物組成變化、功能微生物組成及變化、功能性成分分析、風(fēng)味組分研究、微生物菌落代謝機(jī)理等等，缺乏系統(tǒng)性的研究。不同香型，不同地區(qū)白酒之間的這些研究也缺乏系統(tǒng)的橫向比較。人類基因組測(cè)序完成已有許多年。但是，基因組信息如何指導(dǎo)基因在特定空間和時(shí)間表達(dá)的機(jī)理仍有待闡明。這些問(wèn)題并不能只依賴宏基因組學(xué)解決，基于此，我們可以采用宏基因組學(xué)、宏蛋白組學(xué)，宏代謝組學(xué)，宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)、風(fēng)味組學(xué)等方法，并結(jié)合全基因組的三維空間結(jié)構(gòu)和功能研究，更加系統(tǒng)深入的研究認(rèn)識(shí)白酒釀造過(guò)程和組成成分。