吉哈利，王玉恒，于子淇

（西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠，西藏 拉薩 850000）

非洲綠猴腎細胞（vero細胞），是一種從非洲綠猴腎上皮細胞分離出來的異倍體細胞[1]。1962年，日本學者Y.Yasumura和Y.Kawakita分離培養(yǎng)出此細胞系[2，3]，具有生長速度快、連續(xù)傳代、遺傳穩(wěn)定、對病毒廣泛適應(yīng)譜等優(yōu)點，也是經(jīng)世界衛(wèi)生組織（World health Organization，WHO）和《中國藥典》認可的應(yīng)用于人用疫苗和動物疫苗的細胞系，故迅速推動了該細胞系應(yīng)用于病毒性疫苗、基因工程疫苗等生物制品。現(xiàn)已廣泛作用于乙型腦炎、輪狀病毒、小反芻獸疫病毒等疫苗的細胞基質(zhì)[4，6]。因此vero細胞在生物制品研發(fā)過程中具有非常重要的作用。

迄今為止，對vero細胞的培養(yǎng)條件以及在動物疫苗研發(fā)等方面的研究越來越多。例如，S.F.Chun等[7]開發(fā)適用于懸浮液的vero細胞培養(yǎng)工藝技術(shù)，從而有利于病毒疫苗研發(fā)；R.Samia等[8]研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒接種于懸浮培養(yǎng)vero細胞中可獲得高滴度病毒；Y.Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)了豬流行性腹瀉病毒在vero細胞多次傳代后可獲得弱毒株；薛俊欣等[10]研究發(fā)現(xiàn)DMSO體積分數(shù)低于1%時對vero細胞無明現(xiàn)毒性；韓偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)豬乙型腦炎病毒接種于vero細胞培養(yǎng)96 h后，可獲得較高滴度的病毒。本試驗研究了在不同培養(yǎng)條件下對vero細胞增殖及其檢測病毒含量的影響，初步驗證了培養(yǎng)vero細胞的最佳培養(yǎng)時間和最佳血清濃度，為生物制品的研發(fā)提供一定理論依據(jù)。

1 材料

1.1 細胞及疫苗來源

Vero細胞來源于中國獸藥監(jiān)察所，并經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)至5代后進行試驗。小反芻獸疫活疫苗（clone 9株）來源于西藏自治區(qū)獸醫(yī)生物藥品制造廠且已獲得國家批號，其病毒效價為103.5 TCID50/頭份。

1.2 主要試劑及儀器

DMEM （C11960500BT)、PBS緩沖液（C14190500BT）、胰酶（25200-072）、胎牛血清FBS（16000-044）均購于美國Gibco公司，Cell Counting Kit-8（C0037）購于北京碧云天生物科技公司，其他分析純均為國產(chǎn)。二氧化碳培養(yǎng)箱（MCO-15AC，日本三洋電機株式會社產(chǎn)品）、體視顯微鏡（CX21FS1C，奧林巴斯工業(yè)有限公司產(chǎn)品）、倒置顯微鏡（DSZ5000X，重慶奧浦光電技術(shù)有限公司產(chǎn)品）、酶標分析儀（DNX-9620，北京普朗新技術(shù)有限公司）、臺式高速冷凍離心機（TGL16LMB，湖南星科科學儀器有限公司）、電熱恒溫水浴鍋（HH-2A，北京科偉永興儀器有限公司），其他實驗耗材均為美國Corning公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1 vero細胞復蘇及傳代

從液氮罐中取出凍存vero細胞，放置于37 ℃恒溫水浴鍋中迅速解凍，吸至已加37 ℃培養(yǎng)液的無菌離心管中，離心后棄掉上清液。重新加入37 ℃培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度為4～5×105個/ml，接種于已加37℃培養(yǎng)液的75cm2培養(yǎng)瓶中，于37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞生長至75cm2培養(yǎng)瓶壁80%～90 %時，棄掉上清培養(yǎng)液，用PBS清洗vero細胞2～3次，除去死細胞及異物。加入4 ml胰酶放置37℃培養(yǎng)箱消化2～3 min，再加入37℃培養(yǎng)液終止消化，用于接種96孔板。

2.2 CCK-8法檢測細胞增殖

Vero細胞消化后，離心后棄掉上清液，重新加入37℃培養(yǎng)液，輕輕吹打混勻，血細胞計數(shù)板進行計數(shù)，調(diào)整細胞密度為1×104個/ml，接種于96孔板。本試驗設(shè)立3個試驗組，分別為DMEM、DMEM+5 %FBS、DMEM+10 %FBS，每組設(shè)5個重復孔，其余孔加入100 ul PBS，于37 ℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h。培養(yǎng)到規(guī)定時間后，細胞培養(yǎng)液更換為含10 %CCK-8試劑的細胞培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2.5 h，然后用酶標分析儀檢測波長450 nm時其吸光度OD值，并計算重復孔平均值。

2.3 TCID50測定

Vero細胞消化、離心后，調(diào)整細胞密度為1×104個/ml，接種96孔板，于37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 h后進行同步接毒。本試驗設(shè)立兩個試驗組，分別為DMEM+5 %FBS和DMEM+10 %FBS，每組設(shè)3個重復。取出待測活疫苗，按疫苗說明書稀釋疫苗為1頭份，再進行10倍梯度稀釋至1×10-4，并設(shè)立陰性對照，滴加入96孔板，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h、96 h、120 h、144 h。培養(yǎng)到規(guī)定時間后，觀察細胞病變情況，然后采用Reed-Muench法計算TCID50。

2.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 19.0軟件包中One-way ANOVA對數(shù)據(jù)進行差異顯著性分析。試驗統(tǒng)計數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤（Mean±SD）表示。

3 結(jié)果

3.1 不同培養(yǎng)時間對vero細胞增殖的影響

為探究培養(yǎng)時間對vero細胞增殖的影響，因此本試驗利用CCK-8方法分別檢測了vero細胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h和96 h后細胞增殖的情況。結(jié)果表明：培養(yǎng)時間的差異對vero細胞增殖有顯著作用。由圖1可知，在DMEM培養(yǎng)條件下，vero細胞培養(yǎng)72 h的細胞增殖顯著高于培養(yǎng)24 h、48 h，但與培養(yǎng)96 h的細胞增殖差異不顯著。由圖2可知，在DMEM+5 %FBS培養(yǎng)條件下，vero細胞的增殖趨勢呈逐漸遞增，與DMEM培養(yǎng)條件下細胞增殖趨勢相同。由圖3可知，在DMEM+10 %FBS培養(yǎng)條件下，vero細胞培養(yǎng)96 h的細胞增殖顯著高于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h。

圖1 在DMEM培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時間對vero細胞增殖的影響

圖2 在DMEM+5%FBS培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時間對vero細胞增殖的影響

圖3 在DMEM+10%FBS培養(yǎng)條件下，不同培養(yǎng)時間對vero細胞增殖的影響

3.2 不同血清濃度對vero細胞增殖的影響

為探究培養(yǎng)液中血清濃度對vero細胞增殖的影響，因此本試驗利用CCK-8方法分別檢測了vero細胞在DMEM、DMEM+5 %FBS、DMEM+10 %FBS培養(yǎng)條件下細胞增殖的情況。結(jié)果表明：在培養(yǎng)液中添加不同濃度的血清對vero細胞增殖有顯著作用，其中在vero細胞培養(yǎng)24 h時，不同血清濃度對細胞增殖的影響不顯著（見圖4）；在vero細胞培養(yǎng)48 h時，DMEM+5 %FBS組的細胞增殖顯著高于DMEM組，但與DMEM+10 %FBS組差異不顯著（見圖5）；在vero細胞分別培養(yǎng)72 h和96 h時，DMEM+10 %FBS組的細胞增殖均顯著高于DMEM組、DMEM+ 5 %FBS組（見圖6、圖7）。

圖4 在培養(yǎng)24 h時，不同血清濃度對vero細胞增殖的影響

圖5 在培養(yǎng)48 h時，不同血清濃度對vero細胞增殖的影響

圖6 在培養(yǎng)72 h時，不同血清濃度對vero細胞增殖的影響

表1 不同血清濃度對vero細胞檢測病毒含量的影響

圖7 在培養(yǎng)96 h時，不同血清濃度對vero細胞增殖的影響

3.3 不同血清濃度對vero細胞檢測病毒含量的影響

為研究培養(yǎng)液中血清濃度對vero細胞檢測病毒含量的影響，因此本試驗利用TCID50法計算vero細胞在5 %FBS和10 %FBS培養(yǎng)條件下檢測病毒含量的情況。結(jié)果表明在5 %FBS和10 %FBS培養(yǎng)條件下，vero細胞檢測活疫苗TCID50值的差異不顯著（見表1）。

4 討論

Vero細胞是日本學者Y.Yasumura和Y.Kawakita于1962年從非洲綠猴腎臟分離的異倍體貼附依賴性細胞，并培養(yǎng)出細胞系和不同代次的細胞庫[2，3]。1987年，WHO正式批準vero細胞系可作為生物制品生產(chǎn)的基質(zhì)，迅速推進了人用疫苗和動物疫苗的研發(fā)。例如，Barrett等[12]利用vero細胞生產(chǎn)首個人用疫苗—脊髓灰質(zhì)炎滅活疫苗；R.Samia等[8]研究發(fā)現(xiàn)狂犬病毒接種于懸浮培養(yǎng)Vero細胞中可獲得高滴度病毒；Y.Wu等[9]研究發(fā)現(xiàn)了豬流行性腹瀉病毒在vero細胞多次傳代后可獲得弱毒株；薛俊欣等[10]研究發(fā)現(xiàn)DMSO體積分數(shù)低于1%時對vero細胞無明現(xiàn)毒性；韓偉等[11]研究發(fā)現(xiàn)豬乙型腦炎病毒接種于Vero細胞培養(yǎng)96 h后，可獲得較高滴度的病毒。因此在生物制品研發(fā)過程中vero細胞具有不可替代的作用。

為了驗證vero細胞的培養(yǎng)條件，因此本試驗研究了在不同培養(yǎng)條件下，vero細胞的增殖及其檢測病毒含量的情況。首先，通過CCK-8方法檢測了不同培養(yǎng)時間對vero細胞增殖的影響，結(jié)果表明培養(yǎng)時間的差異對vero細胞增殖有顯著作用。當培養(yǎng)72 h時的細胞增殖趨勢呈逐漸遞增，但72 h之后增殖趨勢較平緩，也進一步說明vero細胞最佳培養(yǎng)時間為72 h；然后，利用CCK-8方法檢測了不同血清濃度對vero細胞增殖的影響，結(jié)果表明：在培養(yǎng)液中添加不同濃度的血清對vero細胞增殖有顯著影響。當vero細胞培養(yǎng)72 h時，添加10%血清的細胞增殖顯著高于不添加血清和添加5%血清，也進一步說明vero細胞最佳血清濃度為10 %；最后利用TCID50法檢測培養(yǎng)液中血清濃度對vero細胞檢測病毒含量的影響，結(jié)果表明：在添加5%血清和10%血清培養(yǎng)條件下，vero細胞檢測活疫苗TCID50值的差異不大，也進一步說明vero細胞檢測活疫苗病毒含量受培養(yǎng)液血清濃度的影響不大。綜上所述，本試驗初步驗證了培養(yǎng)vero細胞的最佳培養(yǎng)時間和最佳血清濃度，為生物制品的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。