高養(yǎng)春, 李海濤, 王孝程, 孫 藝, 戰(zhàn)愛斌, Aileen TAN Shau-Hwai, 李宏俊,*

1 國(guó)家海洋環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,大連 116023 2 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心,北京 100853 3 國(guó)家海洋局南海環(huán)境監(jiān)測(cè)中心,廣州 510300 4 Centre for Marine and Coastal Studies, Universiti Sains Malaysia (USM), 11800, Penang, Malaysia 5 廣東省生物資源應(yīng)用研究所,廣州 510260

浮游動(dòng)物種類多、數(shù)量大、分布廣,是海洋生物多樣性的重要組成部分[1]。作為海洋初級(jí)生產(chǎn)力向高營(yíng)養(yǎng)級(jí)傳遞的關(guān)鍵環(huán)節(jié),浮游動(dòng)物在海洋生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)中起著重要作用,同時(shí)浮游動(dòng)物對(duì)環(huán)境擾動(dòng)非常敏感,其種類組成和群落結(jié)構(gòu)可作為海洋生態(tài)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)變化的重要指示[2],可以為評(píng)價(jià)海洋生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境質(zhì)量和健康狀況提供指標(biāo)[3]。浮游動(dòng)物種類的準(zhǔn)確鑒定是浮游生態(tài)學(xué)研究的基礎(chǔ),傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法無法滿足現(xiàn)代海洋生態(tài)管理與保護(hù)自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)需求,ZOOSCAN圖像識(shí)別[4]和DNA條形碼技術(shù)[5]等新技術(shù)的出現(xiàn),極大推動(dòng)了浮游動(dòng)物分類學(xué)、生態(tài)學(xué)及相關(guān)領(lǐng)域的研究進(jìn)展。

為加強(qiáng)海洋生態(tài)監(jiān)測(cè)和強(qiáng)化海洋生態(tài)管理,我國(guó)自2003年開始組織建立海洋生態(tài)監(jiān)控區(qū)并實(shí)施業(yè)務(wù)化監(jiān)測(cè),目前已經(jīng)在我國(guó)近岸海域生態(tài)脆弱區(qū)和敏感區(qū)建立了21個(gè)生態(tài)監(jiān)控區(qū)。海洋生物多樣性是生態(tài)監(jiān)控區(qū)業(yè)務(wù)化監(jiān)測(cè)的重要內(nèi)容,其目的是掌握海洋生物種類和數(shù)量的分布及變化趨勢(shì),監(jiān)測(cè)對(duì)象包括浮游植物、浮游動(dòng)物、底棲生物和游泳動(dòng)物等[6]。浮游動(dòng)物類群具有多樣性高的特點(diǎn),傳統(tǒng)基于形態(tài)學(xué)的顯微計(jì)數(shù)法對(duì)鑒定人員的專業(yè)技能要求較高,并且不同鑒定人員的結(jié)果可比性較差,導(dǎo)致不同年際間的結(jié)果也缺乏可比性,這些缺陷導(dǎo)致基于形態(tài)學(xué)的鑒定方法難以滿足業(yè)務(wù)化監(jiān)測(cè)的需求,因此,急需開發(fā)自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化的浮游動(dòng)物種類鑒定技術(shù)[5,7]。此外,在海洋浮游動(dòng)物中,隱存種廣泛存在,形態(tài)鑒定導(dǎo)致種類多樣性被低估[8]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和浮游動(dòng)物DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的不斷擴(kuò)充,分子鑒定為浮游動(dòng)物種類鑒定及多樣性的評(píng)估提供了機(jī)遇,基于高通量測(cè)序的宏DNA條形碼技術(shù)為浮游生物物種、種群和群落的分子生態(tài)鑒定和生態(tài)監(jiān)測(cè)提供了契機(jī)[9- 12]。在業(yè)務(wù)監(jiān)測(cè)領(lǐng)域,分子鑒定技術(shù)在歐洲水框架指令(European Water Framework Directive)已經(jīng)成為生物種類形態(tài)鑒定的有益補(bǔ)充,甚至在未來有望取代形態(tài)鑒定[13]。我國(guó)海域遼闊,跨越溫帶、亞熱帶和熱帶三個(gè)氣候帶,生物多樣性豐富,我國(guó)海洋生物多樣性監(jiān)測(cè)急需準(zhǔn)確和高效的技術(shù)方法。

自2003年Hebert等[14]提出DNA條形碼技術(shù)以來,DNA條形碼技術(shù)和數(shù)據(jù)庫(kù)不斷完善,目前生命條形碼聯(lián)盟(The Consortium for the Barcode of Life,CBOL)已經(jīng)擁有來自40多個(gè)國(guó)家的120多個(gè)成員組織,生命條形碼數(shù)據(jù)系統(tǒng)(The Barcode of Life Data System,BOLD)已經(jīng)收錄DNA條形碼序列超過600萬條。選擇合適的DNA條形碼是開展分子種類鑒定的基礎(chǔ),需要滿足合適的變異速率、足夠的分辨率、保守的通用引物等條件[15]。在浮游動(dòng)物DNA條形碼研究中應(yīng)用較多的標(biāo)記包括核糖體大亞基(Ribosomal Large Subunit, LSU)、核糖體小亞基(Ribosomal Small Subunit, SSU)和線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(Cytochrome Oxidase Subunit I, COI)等[9],不同條形碼在實(shí)際應(yīng)用中各有優(yōu)缺點(diǎn)。SSU因具有較快的進(jìn)化速率且易于設(shè)計(jì)出覆蓋較廣物種類別的通用引物而廣泛應(yīng)用于基于宏條形碼水生生物多樣性的研究中[16- 19]。

本研究在鴨綠江口海域采集了22份浮游動(dòng)物樣品,分別利用宏條形碼鑒定方法和形態(tài)鑒定方法分析浮游動(dòng)物群落組成,并通過比較兩種方法得出的多樣性指數(shù)來評(píng)價(jià)基于高通量測(cè)序的宏條形碼分子鑒定方法在我國(guó)海洋生物多樣性業(yè)務(wù)化監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用潛力。

1 試驗(yàn)方法

1.1 樣品采集

2017年8月沿鴨綠江入?？谠谥袊?guó)海域布設(shè)22個(gè)浮游動(dòng)物站位(圖1)進(jìn)行采樣。使用淺水II型浮游生物網(wǎng)(網(wǎng)目孔徑0.160 mm,網(wǎng)口內(nèi)徑31.6 cm,網(wǎng)長(zhǎng)140 cm),依據(jù)《海洋監(jiān)測(cè)規(guī)范》(GB 17378.7—2007)采集浮游動(dòng)物樣品。每個(gè)站位采集的樣品進(jìn)行充分混勻后均分成兩份：一份用5%甲醛固定用于形態(tài)學(xué)鑒定,另一份用同孔徑篩絹過濾掉海水后,加入無水乙醇固定用于分子鑒定。

圖1 鴨綠江口海域浮游動(dòng)物樣品采集點(diǎn)Fig.1 Sampling sites along the coastal regions of Yalvjiang Estuary

1.2 種類鑒定

形態(tài)鑒定：在體視顯微鏡下對(duì)浮游動(dòng)物樣品進(jìn)行分類鑒定和計(jì)數(shù)。

分子鑒定：分別從每份酒精(總體積100 mL)保存的樣品中分三次吸取浮游動(dòng)物樣品,每次吸取10 mL,三次吸取的浮游動(dòng)物樣品合并在一起,并用20 μm的篩絹過濾,除去酒精及殘留的浮游藻類等。采用DNA血液及組織提取試劑盒(Qiagen Canada lnc., ON, Canada)提取浮游動(dòng)物基因組DNA,提取的DNA采用NanoDrop 2000(Thermo Scientific lnc., USA)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。利用浮游動(dòng)物通用引物(Uni18S:AGGGCAAKYCTGGTGCCAGC; Uni18SR:GRCGGTATCTRATCGYCTT)擴(kuò)增核糖體小亞基的V4區(qū)[20],此引物已證實(shí)可以成功擴(kuò)增幾乎所有的浮游動(dòng)物類別[21]。為了將22份浮游動(dòng)物樣品進(jìn)行混合測(cè)序,我們對(duì)每份樣品聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增(Polymerase Chain Reaction, PCR)的引物添加8堿基的條形碼,同時(shí)也便于后續(xù)數(shù)據(jù)的拆分。PCR反應(yīng)體系如下(25 μL)：1×Ex Taq Buffer(20 mmol/L Mg2+plus, TaKaRa, 大連,中國(guó)),5.0 mmol/L dNTP,15 pmol含barcodes的引物,100 ng 基因組DNA；PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5min,35個(gè)PCR循環(huán)(95℃ 30s,50℃ 45s,72℃ 30s),72℃ 7min的延伸；為了保證取樣的均一性,每個(gè)樣品進(jìn)行8次PCR重復(fù)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳質(zhì)檢后用Qiagen PCR production purification kit進(jìn)行PCR產(chǎn)物的純化,純化的DNA經(jīng)NanoDrop 2000定量后進(jìn)行樣品間的等量混合。構(gòu)建好的文庫(kù)于Miseq PE300進(jìn)行測(cè)序。

高通量測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)用fastaq_strip_barcode.relablel2.py腳本進(jìn)行數(shù)據(jù)的拆分并去除非生物學(xué)序列,如測(cè)序接頭、樣品標(biāo)簽序列及引物。利用USEARCH V8.1對(duì)拆分的數(shù)據(jù)進(jìn)行長(zhǎng)度的修剪、質(zhì)量過濾、操作分類單元(Operational Taxonomic Units, OTUs)聚類等處理。因源于Miseq PE300的序列右端的測(cè)序質(zhì)量急劇下降,尤其是最后20 bp,故將所有數(shù)據(jù)右端的20 bp刪除,以提高序列的整體質(zhì)量。質(zhì)量過濾采用USEARCH V8.1推薦的方法,將期望誤差閾值設(shè)為1.0。采用97%的閾值進(jìn)行OTUs的聚類。除此之外,在后續(xù)的數(shù)據(jù)分析中,我們采用不刪除OTUs單體、二體及三體的方式,因?yàn)檫@些物種可能是真實(shí)存在的物種,只是以低豐度的形式存在[20]。采用SEED V1.46[22]軟件對(duì)聚類出OTUs比對(duì)到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)中的非冗余蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)(Non-Redundant Protein Sequence Database, NR)中進(jìn)行物種的注釋。比對(duì)的結(jié)果只保留序列的覆蓋度大于85%、相似度大于90%的注釋結(jié)果[20]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

為便于宏條形碼鑒定方法與形態(tài)學(xué)方法的比較,我們選取海洋浮游動(dòng)物中豐度較高的橈足亞綱(Copepoda)進(jìn)行分析。采用PRIMER 6.0[23]計(jì)算形態(tài)學(xué)及分子鑒定物種的多樣性指數(shù),包括物種豐度(Species richness)和香濃維納多樣性指數(shù)(Shannon Winner diversity index)。采用SPSS 18.0并應(yīng)用Pearson相關(guān)系數(shù)對(duì)兩種方法多樣性指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

圖2 鴨綠江口22個(gè)浮游動(dòng)物樣品高通量測(cè)序稀疏曲線 Fig.2 Rarefaction plots of 22 zooplankton samples based on metabarcoding methodsOTUs：操作分類單元 Operational Taxonomic Units

高通量測(cè)序總計(jì)產(chǎn)出291.6萬條序列,每個(gè)采樣點(diǎn)得到的序列數(shù)在7.3萬至27.0萬之間,平均為13.3萬條,數(shù)據(jù)已上傳到NCBI (SRA accession: PRJNA490610)。經(jīng)去除重復(fù)序列、OTUs聚類等步驟,共獲得1957個(gè)OTUs。序列數(shù)與物種數(shù)(OTUs)關(guān)系的稀疏曲線(圖2)顯示：隨著序列數(shù)的急劇升高,物種數(shù)增加的速度逐漸變慢,表明各采樣點(diǎn)的測(cè)序量足夠覆蓋大部分的種類。將獲得的OTUs與NR進(jìn)行比對(duì),成功注釋1502個(gè),其中229個(gè)OTUs被注釋為浮游橈足亞綱(Copepoda),隸屬于4目、23科、32屬(表1)。共鑒定浮游橈足類1069394條序列,其中哲水蚤目(Calanoida)包含12屬(57.628%),劍水蚤目(Cyclopoida)包含6屬(36.359%),鞘口水蚤目(Poecilostomatoida)包含12屬(5.406%),管口虱目(Siphonostomatoida)包含2屬(0.607%)；并且樣點(diǎn)內(nèi)哲水蚤目和鞘口水蚤目相對(duì)豐度沿采樣點(diǎn)1至12逐漸升高,而劍水蚤目和管口虱目相對(duì)豐度沿采樣點(diǎn)1至12逐漸下降(圖3)。在這些屬中,豐度最高的種類分別為擬哲水蚤屬(Paracalanus)和長(zhǎng)腹劍水蚤屬(Oithona),且樣點(diǎn)內(nèi)擬哲水蚤屬(Paracalanus)的相對(duì)豐度沿采樣點(diǎn)1至22逐漸升高,而長(zhǎng)腹劍水蚤屬(Oithona)具有逐漸降低的趨勢(shì)(圖4)。

基于形態(tài)學(xué)特征,共鑒定出橈足綱3目、5科、5屬、6種(表1；圖5；圖6)。哲水蚤目(Calanoida)包含4屬(66.67%),劍水蚤目(Cyclopoida)和鞘口水蚤目(Poecilostomatoida)各包含1屬(16.67%)；且哲水蚤目(Calanoida)的相對(duì)豐度沿采樣點(diǎn)1至12逐漸降低,而鞘口水蚤目(Poecilostomatoida)逐漸升高(圖5)。其中豐度最高的物種是擬哲水蚤屬(Paracalanus),在大部分采樣點(diǎn)擬哲水蚤屬(Paracalanus)所占的比例均較高,少部分采樣點(diǎn)(7和8)長(zhǎng)腹劍水蚤屬(Oithona)所占的比例較高(圖6)；并且擬哲水蚤屬(Paracalanus)的相對(duì)豐度沿采樣點(diǎn)1至12逐漸降低,而屬于鞘口水蚤目(Poecilostomatoida)的劍水蚤屬(Corycaeus)相對(duì)豐度逐漸升高(圖6)。

表1 基于宏條形碼分子鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定的浮游橈足類

圖3 在目水平分子鑒定物種相對(duì)豐度Fig.3 Histogram of relative abundance for each sampling site based on metabarcoding method at the order level

圖4 在屬水平分子鑒定物種相對(duì)豐度Fig.4 Histogram of relative abundance for each sampling site based on metabarcoding method at the genera level

圖5 在目水平形態(tài)鑒定物種相對(duì)豐度Fig.5 Histogram of relative abundance for each sampling site based on morphological method at the order level

圖6 在種水平形態(tài)鑒定物種相對(duì)豐度Fig.6 Histogram of relative abundance for each sampling site based on morphological method at the species level

基于高通量測(cè)序的宏條形碼分子鑒定方法每個(gè)采樣點(diǎn)平均鑒定出19個(gè)屬,樣點(diǎn)間的屬數(shù)變異為15—22,而基于形態(tài)學(xué)方法每個(gè)采樣點(diǎn)平均鑒定出4個(gè)屬,樣點(diǎn)間的屬數(shù)變異為3—5(表2)。利用形態(tài)學(xué)方法鑒定出來的大部分類別(目：100%、科：80%、屬：80%)同時(shí)能用分子方法鑒定出來,而分子方法鑒定出的大部分類別(目：25%、科：83%、屬：88%)卻不能用形態(tài)學(xué)方法鑒定出來(表1)。對(duì)于物種多樣性指數(shù),基于分子鑒定的物種豐度指數(shù)均高于基于形態(tài)學(xué)特征鑒定的結(jié)果(圖7,表2)。同時(shí),基于分子方法鑒定的平均香濃維納指數(shù)(1.52±0.23)也高于基于形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果(1.32±0.32)(表2)。對(duì)于大部分采樣點(diǎn),基于分子方法鑒定的香濃維納指數(shù)與基于形態(tài)學(xué)方法鑒定得出的香濃維納指數(shù)差異較小,只有在較少的采樣點(diǎn)(1、2、3、4及15)中發(fā)現(xiàn)兩種方法鑒定的結(jié)果存在較大的差異(圖8)。

表2 基于宏條形碼分子鑒定和形態(tài)學(xué)鑒定浮游橈足類在屬水平的多樣性指數(shù)

圖7 分子和形態(tài)鑒定結(jié)果的物種豐度比較 Fig.7 Variation of species richness index along the sampling sites based on both metabarcoding and morphological methods

圖8 分子鑒定和形態(tài)鑒定結(jié)果的香濃維納指數(shù)比較 Fig.8 Variation of Shannon-Wiener index along the sampling sites based on metabarcoding and morphological methods

而在一致性方面,對(duì)于所有采樣點(diǎn),基于分子鑒定與基于形態(tài)鑒定得出的多樣性指數(shù)沒有顯著的一致性(r=0.080,P=0.723,圖9)。但當(dāng)排除香濃維納指數(shù)差異較大的少量采樣點(diǎn)(1、2、3、4及15,22.73%),只關(guān)注差異較小的多數(shù)樣點(diǎn)(77.27%)時(shí),基于分子與基于形態(tài)的香濃維納指數(shù)呈現(xiàn)顯著的一致性(r=0.542,P=0.024,圖10)。

圖9 基于所有采樣點(diǎn)分子鑒定與形態(tài)鑒定的香濃維納指數(shù)相關(guān)性Fig.9 Correlation of Shannon-Wiener index between metabarcoding and morphological methods for all sampling sites

圖10 基于大部分采樣點(diǎn)(77.28%)分子鑒定與形態(tài)鑒定的香濃維納指數(shù)相關(guān)性Fig.10 Correlation of Shannon-Wiener diversity index between metabarcoding and morphological methods for most sampling sites (77.28%)

3 討論

DNA宏條形碼技術(shù)基于標(biāo)準(zhǔn)化DNA序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增、高通量測(cè)序和比對(duì),可以實(shí)現(xiàn)不同物種的批量鑒定。伴隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展和DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)的擴(kuò)充,宏DNA條形碼可以同時(shí)完成批量樣品中批量物種的分子種類鑒定,從而實(shí)現(xiàn)全面、快速評(píng)估群落種類組成和物種多樣性的目的。利用DNA宏條形碼進(jìn)行種類鑒定需要選擇合適的標(biāo)準(zhǔn)序列和相應(yīng)的通用引物,標(biāo)準(zhǔn)序列需要具備足夠的種間DNA變異,通用引物需要實(shí)現(xiàn)不同類群的高效擴(kuò)增。由于DNA條形碼在不同類群的分辨率和通用性不同,目前尚未找到適用于所有分類階元的通用引物。海洋浮游動(dòng)物DNA條形碼研究常用的標(biāo)準(zhǔn)序列包括LSU、SSU和COI等[12]。雖然COI具有較高的物種分辨率,但因其物種間具有較大的序列變異,導(dǎo)致無法在較廣的分類單元上設(shè)計(jì)出通用引物,這限制了其在宏條形碼分子鑒定中的應(yīng)用。盡管SSU物種分辨率不及COI,但可以設(shè)計(jì)出通用性較好的引物,可較好地用于物種多樣性的評(píng)價(jià)。本文選取的Uni18S-Uni18SR[20]已廣泛應(yīng)用于海洋及淡水生物多樣性的評(píng)價(jià)中[24-25]。雖然此引物并不能將所有物種鑒定到種的水平,但對(duì)大部分種類而言鑒定到科及屬水平具有較高可信度[20-21]。利用此引物進(jìn)行宏條形碼的測(cè)定及分析鑒定出了大量的物種類別,宏條形碼分子方法鑒定出的物種豐度明顯高于形態(tài)學(xué)鑒定出的物種豐度：基于分子鑒定出的橈足類的類別在科及屬水平上明顯多于形態(tài)學(xué)鑒定,發(fā)現(xiàn)了基于形態(tài)學(xué)特征無法鑒定出的管口水蚤目,且鑒定出了基于形態(tài)學(xué)特征無法分類的幼蟲期橈足類。此結(jié)果與國(guó)外在浮游動(dòng)物、底棲生物及浮游藻類的研究結(jié)果一致[26-28]。這些發(fā)現(xiàn)表明基于高通量測(cè)序的分子鑒定方法可揭示出傳統(tǒng)基于形態(tài)學(xué)特征鑒定方法無法揭示出的物種多樣性。

本研究中,雖然對(duì)于小部分采樣點(diǎn)(22.73%),基于分子的多樣性指數(shù)高于形態(tài)鑒定出的多樣性指數(shù)；但對(duì)于大部分采樣點(diǎn)(77.27%),基于分子的多樣性指數(shù)均低于形態(tài)鑒定出的多樣性指數(shù),并且變化趨勢(shì)呈現(xiàn)顯著的一致性(r=0.542,P=0.024)。國(guó)外的研究中也普遍發(fā)現(xiàn)類似的結(jié)果[29-30]。Lejzerowicz等[30]在蘇格蘭的利斯莫爾島海域采集了10個(gè)樣品,通過比較基于宏條形碼和形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果發(fā)現(xiàn),基于兩種方法得出的生物評(píng)價(jià)指數(shù)(Infaunal Trophic Index 和AZTI Marine Biotic Index)具有較高的一致性(P< 0.01)。這些結(jié)果表明在海洋浮游動(dòng)物多樣性評(píng)價(jià)中,分子鑒定的結(jié)果與形態(tài)鑒定的結(jié)果具有較好的可比性。

與形態(tài)學(xué)鑒定方法相比,分子鑒定除了具有省時(shí)、省力、不需要專業(yè)的形態(tài)學(xué)鑒定人員等優(yōu)點(diǎn)外[12,18, 30-31],還具有能鑒定出光學(xué)顯微鏡下難以發(fā)現(xiàn)的物種的優(yōu)點(diǎn),致使鑒定出的種類豐度明顯高于形態(tài)學(xué)鑒定出的結(jié)果。本研究中利用形態(tài)鑒定得到的分類階元多數(shù)(目：100%、科：80%、屬：80%)能用宏條形碼方法鑒定出來,而分子方法鑒定得到的分類階元多數(shù)(目：25%、科：83%、屬：88%)卻未能用形態(tài)鑒定出來基于宏條形碼方法得出,此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這個(gè)觀點(diǎn)的正確性。且宏條形碼鑒定方法已在國(guó)外的海洋生物多樣性評(píng)價(jià)中得到了廣泛的應(yīng)用[16- 18],在我國(guó)海洋浮游動(dòng)物多樣性評(píng)價(jià)中具有較高的應(yīng)用潛力。

在海洋浮游動(dòng)物多樣性評(píng)價(jià)所需成本方面,我們估算了鑒定每份浮游動(dòng)物樣本所需的時(shí)間成本和經(jīng)濟(jì)成本(表3),根據(jù)國(guó)家海洋局印發(fā)的《海域使用論證收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)(試行)》,對(duì)于浮游動(dòng)物的鑒定,每個(gè)站位的樣品(包含I型網(wǎng)和II型網(wǎng)兩份樣品)鑒定需要花費(fèi)1500元,每個(gè)樣品的鑒定費(fèi)用也將約在750元。而利用宏條形碼分子鑒定,一個(gè)站位的花費(fèi)僅為103—203元(建庫(kù)費(fèi)用60元+Miseq測(cè)序費(fèi)用135元/Hiseq測(cè)序費(fèi)用35元+分析費(fèi)用8元),約是采用形態(tài)學(xué)方法所需花費(fèi)的1/13—1/27之間。而隨著測(cè)序成本的不斷降低及形態(tài)學(xué)鑒定所需人工成本的不斷增加,這種差距還將持續(xù)增加。根據(jù)我國(guó)海洋監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)反映,完成1個(gè)浮游動(dòng)物樣品物種鑒定及多樣性分析的時(shí)間為1.5—3個(gè)小時(shí),而利用宏條形碼技術(shù)完成22份浮游動(dòng)物樣品分析總共需要一個(gè)普通環(huán)境監(jiān)測(cè)人員20個(gè)小時(shí)(8個(gè)小時(shí)建庫(kù)+12小時(shí)數(shù)據(jù)分析),平均每份樣品花費(fèi)約1小時(shí)。從時(shí)間成本考慮,利用宏條形碼技術(shù)所需的時(shí)間僅為形態(tài)學(xué)鑒定的1/3—1/2,表明利用宏條形碼技術(shù)極大地提高了浮游動(dòng)物分析工作的效率。

表3 基于宏條形碼和形態(tài)學(xué)鑒定方法的每份浮游動(dòng)物樣本所需金錢成本與時(shí)間成本

目前DNA宏條形碼鑒定技術(shù)在我國(guó)海洋浮游動(dòng)物業(yè)務(wù)化監(jiān)測(cè)應(yīng)用,仍有幾個(gè)方面有待于提升。首先,同一個(gè)種的不同地理種群會(huì)因遺傳漂變、建群者效應(yīng)及自然選擇等進(jìn)化生態(tài)學(xué)過程發(fā)生遺傳分化[32-34],尤其在較大的地理尺度上如大洋、區(qū)域甚至國(guó)家之間[35]。如果遺傳分化發(fā)生在宏條形碼所選擇的引物區(qū)間,歐美國(guó)家所構(gòu)建的參考數(shù)據(jù)庫(kù)可能就會(huì)不適用于我國(guó)。所以,宏條形碼鑒定方法可靠的前提是建立我國(guó)甚至我國(guó)特定海域的條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)。其次,本研究中,對(duì)于浮游動(dòng)物類群,之所以一部分形態(tài)學(xué)鑒定出的種類沒有被宏條形碼方法鑒定出,可能是因?yàn)閿?shù)據(jù)庫(kù)中沒有對(duì)應(yīng)的物種序列,也有可能是因?yàn)楸狙芯恐兴捎玫暮陾l形碼引物序列并不能與這些物種的相應(yīng)的序列很好的匹配。所以,在今后的研究工作中應(yīng)根據(jù)我國(guó)海域浮游動(dòng)物條形碼的序列特征,對(duì)現(xiàn)有的宏條形碼引物進(jìn)行改進(jìn)或者重新設(shè)計(jì)適應(yīng)于我國(guó)海域浮游動(dòng)物分子特征的引物,以提高宏條形碼方法鑒定物種類別的覆蓋度,另外,構(gòu)建本地化DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)也是開展基于DNA條形碼浮游動(dòng)物種類業(yè)務(wù)化監(jiān)測(cè)的必要條件。最后,在PCR擴(kuò)增及高通量測(cè)序過程均會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性及假陰性的錯(cuò)誤,雖然PCRfree建庫(kù)策略能有效減少假陽(yáng)性的錯(cuò)誤[21],但在高通量測(cè)序過程中容易丟失豐度較低的物種而引起假陰性,在未來的生物信息學(xué)領(lǐng)域,通過改進(jìn)現(xiàn)有軟件或開發(fā)新軟件有望降低這些過程所引起的錯(cuò)誤。

現(xiàn)階段,形態(tài)學(xué)鑒定方法是我國(guó)海洋浮游生物多樣性監(jiān)測(cè)的主要手段。因其在生物多樣性評(píng)價(jià)中存在許多方面的缺陷,尤其比較耗時(shí)費(fèi)力,致使很難在短期內(nèi)完成大尺度多樣品的多樣性評(píng)價(jià)工作。而基于高通量測(cè)序的宏條形碼方法提供了可供選擇的海洋浮游生物多樣性快速評(píng)價(jià)方法。雖然宏條形碼技術(shù)具有其固有缺陷,如不能反映生物的生長(zhǎng)階段,無法準(zhǔn)確對(duì)浮游生物進(jìn)行準(zhǔn)確定量等。但因其具有鑒定效率高、花費(fèi)較低等優(yōu)點(diǎn)使其有望在未來成為一種互補(bǔ)甚至替代現(xiàn)有評(píng)價(jià)方法的技術(shù)體系。隨著宏條形碼技術(shù)體系的不斷完善,我國(guó)有可能在海洋浮游生物多樣性評(píng)價(jià)方法方面打破既有的體系,形成新的技術(shù)體系及規(guī)范。