莫 晶楊紅蘭劉 含金 皎范安然張 鵬周艷華*舒莉萍*

(1.貴州醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞工程生物醫(yī)藥技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,貴州省再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州醫(yī)科大學(xué)免疫教研室,貴陽 550004;2.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院成體干細(xì)胞轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,組織工程與干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中心,貴陽 550004;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科,貴陽 550004)

腫瘤發(fā)生和發(fā)展伴隨著基因組甲基化水平的巨大改變[1],具體表現(xiàn)為腫瘤基因組整體低甲基化,而腫瘤抑制因子往往存在局部高甲基化[2]。哺乳動物細(xì)胞中基因組的甲基化主要由DNA甲基轉(zhuǎn)移酶建立并維持的[3],而基因組中的去甲基化主要認(rèn)為是由于細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制之后甲基轉(zhuǎn)移酶功能失效造成的[4]。除了DNA復(fù)制導(dǎo)致的DNA去甲基化,據(jù)報道,10-11易位蛋白(ten-eleven translocation,Tet)也參與DNA去甲基化,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化[5]。

哺乳動物的Tet蛋白家族包括三個成員：Tet1、Tet2、Tet3。它們都具有羧基末端的催化結(jié)構(gòu)域(catalytic domain,CD),即富含半胱氨酸區(qū)域(Cysrich)和雙鏈β螺旋區(qū)域(DSBH),功能上都具有催化5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶(5hmC)氧化活性[6]。有研究報道,Tet蛋白在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。Tet蛋白與血液惡性腫瘤[7-8]以及實(shí)體瘤(包括結(jié)腸癌[9]、乳腺癌[10]和前列腺癌[11])相關(guān),編碼Tet蛋白的基因突變失去催化5mC轉(zhuǎn)變?yōu)?hmC的去甲基化能力導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[12]。因此,通過調(diào)節(jié)Tet蛋白氧化活性來改變基因甲基化水平,可能是腫瘤的治療靶點(diǎn)之一。另外,Tet蛋白在干細(xì)胞的多能性獲得[13-14]和喪失[15]過程中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)旨在以HEK293T為模型,構(gòu)建誘導(dǎo)Tet1CD過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,初步探索Tet1蛋白對細(xì)胞增殖、凋亡及周期的影響,為進(jìn)一步研究Tet蛋白功能及相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

質(zhì)粒pTRE-Tight_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro和 pCAG_EGFP_Tet1CD信息參見文獻(xiàn)[16],pCMV(CAT)T7-SB100哺乳轉(zhuǎn)座質(zhì)粒(睡美人)(淼靈生物)。

1.2 主要試劑與儀器

割膠回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶NotⅠ、SfaAⅠ、T4 DNA連接酶(ThermoFisher);DH5α感受態(tài)及質(zhì)粒提取試劑盒(天根);轉(zhuǎn)染試劑 LipofectamineTM3000(Invitrogen);Opti-MEM I Reduced Serum Medium(Gbico);細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM、青鏈霉素混合液、FBS(BI);多西環(huán)素(Doxycycline,Dox)、嘌呤霉素(Puromycin,Puro)、亞甲藍(lán)、β-actin(Sigma);酚氯仿抽提 DNA試劑、蛋白裂解液(索萊寶);TGX Stain-FreeTMFASTCASTTMAcrylamide Kit、Bio-Dot apparatus微濾裝置(Biorad);大鼠源 anti-Tet1(mAb)、兔源anti-5hmC(pAb)(Activemotif);HRP-羊抗兔二抗、HRP羊抗大鼠二抗(ThermoFisher);凋亡檢測試劑盒和周期檢測試劑(美國BD);流式細(xì)胞儀(ACEA novocyte);人胚胎腎細(xì)胞系(HEK293T)(中喬新舟)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 質(zhì)粒構(gòu)建及酶切驗(yàn)證

通過限制性內(nèi)切酶NotⅠ和SfaAⅠ37℃過夜雙酶切pTRE-Tight_IRES_RFP_RPBSA_M2rtTA_Puro和pCAG_EGFP_Tet1CD質(zhì)粒。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后割膠回收目的片段。連接后經(jīng)DH5α感受態(tài)轉(zhuǎn)化,在氨芐霉素抗性的瓊脂平板上涂板,37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆菌落,擴(kuò)大培養(yǎng)后提取重組質(zhì)粒。

1.3.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與篩選

(1)細(xì)胞的準(zhǔn)備

人胚胎腎細(xì)胞系(HEK293T)按每孔5×105接種至六孔板內(nèi),過夜培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)60%～80%時進(jìn)行脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染。

(2)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：

A,稀釋脂質(zhì)體：125 μL opti-MEM+5 μL lipofectation;B,稀釋DNA：125 mL opti-MEM+2.5 μg DNA(重組質(zhì)粒和“睡美人”質(zhì)粒各1.25μg)+5μL P3000;各自混勻后將稀釋后的脂質(zhì)體加入DNA管中,吹打混勻后室溫下放置15 min。將脂質(zhì)體-DNA混合物逐滴滴加至六孔板內(nèi)。培養(yǎng)于含10%FBS和1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,置于37℃,5%CO2孵箱中常規(guī)培養(yǎng)。

(3)細(xì)胞篩選

雙質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染后24 h,予細(xì)胞換液處理,持續(xù)用含2μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行壓迫篩選,能正常生長的證明是轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞。

1.3.3 細(xì)胞鑒定

(1)Western blot檢測Tet1CD蛋白表達(dá)

RIPA裂解液(索萊寶)提取構(gòu)建好的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞的細(xì)胞總蛋白,分為Dox誘導(dǎo)組和未誘導(dǎo)組(對照組),100℃ 變性。TGX Stain-FreeTMFASTCASTTMAcrylamide Kit配制10%電泳膠對各組蛋白進(jìn)行電泳,曝光觀察各泳道內(nèi)總蛋白情況后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維膜(NC膜)上,3%脫脂奶粉室溫下封閉1 h,加入1∶5000 Tet1一抗室溫下孵育1 h,PBST洗滌3次,每次10 min。1∶5000辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗大鼠二抗孵育1 h,PBST洗滌3次,每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

(2)DNA blot檢測5hmC信號

酚氯仿法提取293T(Tet1CD)+Dox組和293T(Tet1CD)細(xì)胞系的基因組DNA(gDNA)后,將兩組gDNA倍比稀釋,使得等體積溶液內(nèi)DNA分別為400 ng、200 ng、100 ng、50 ng,加入20×SSC 使其終濃度變?yōu)?6×SSC。將各管中的 gDNA經(jīng) Bio-Dot apparatus微濾裝置轉(zhuǎn)膜至NC膜上,晾干后亞甲藍(lán)染色5 min后定量兩組gDNA的同一性。在兩組上樣的gDNA同一性一致的情況下,按上述步驟稀釋gDNA后進(jìn)行100℃ 10 min熱變性,變性后立即插入冰中,在冰上加入20×SSC使其濃度為6×SSC。轉(zhuǎn)膜后用3%脫脂奶粉在25℃封閉1 h。1∶10000的5hmC一抗室溫孵育1 h。PBST洗滌3次,每次10 min。1∶5000的HRP-羊抗兔IgG室溫孵育1 h。PBST洗滌3次,每次10 min。ECL化學(xué)發(fā)光顯影。

1.3.4 檢測Tet蛋白對于細(xì)胞周期、凋亡及增殖的影響

(1)細(xì)胞分組

空白對照組HEK293T：用單純完全培養(yǎng)基培養(yǎng)的HEK293T;陰性對照組 HEK293T+Dox：用含1μg/mL多西環(huán)素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)HEK293T;實(shí)驗(yàn)組HEK293T(Tet1CD)+Dox：用1μg/mL多西環(huán)素的培養(yǎng)基培養(yǎng)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞293T(Tet1CD)以誘導(dǎo)Tet1CD過表達(dá)。

(2)細(xì)胞增殖

將細(xì)胞按上述分組,各接種5000個細(xì)胞至12孔板內(nèi)分組培養(yǎng)。 在24 h、48 h、72 h、96 h分別將各孔細(xì)胞消化后取相同體積的細(xì)胞懸液用計數(shù)板顯微鏡下計數(shù)。

(3)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期

將細(xì)胞按上述分組培養(yǎng),將培養(yǎng)96 h后的細(xì)胞分別消化計數(shù),收集大約2×105個細(xì)胞進(jìn)行AnnexinⅤ-FITC/7AAD染色,15 min后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行凋亡檢測。同時每組收集大約1×105萬個細(xì)胞,加入75%預(yù)冷乙醇4℃固定過夜,加入 PI染色10 min后在流式細(xì)胞儀上進(jìn)行周期檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建和酶切驗(yàn)證

如圖1A所示,本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建可誘導(dǎo)型(tet operator)、RFP(dsRed)標(biāo)記、表達(dá)Tet1CD的重組質(zhì)粒,該質(zhì)粒同時具有氨芐的原核抗性和嘌呤霉素的真核抗性。將重組質(zhì)粒與原質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ和SfaAⅠ雙酶切后進(jìn)行電泳驗(yàn)證。結(jié)果顯示,重組質(zhì)粒(圖1B,泳道2)在大約2000 bp位置和8000 bp位置附近各有一條帶,與理論上2084 bp和7145 bp的虛擬酶切相符。說明重組質(zhì)粒構(gòu)建正確。

2.2 Western blot驗(yàn)證Tet1CD蛋白的表達(dá)

如圖2結(jié)果顯示,當(dāng)所有樣品中細(xì)胞總蛋白加載量無顯著差異時(P=0.6575);與未加Dox誘導(dǎo)的對照組相比,誘導(dǎo)組細(xì)胞中Tet1蛋白表達(dá)量顯著增加,P＜0.001。說明構(gòu)建的細(xì)胞系中Tet蛋白可以穩(wěn)定表達(dá)。

2.3 DNA dot blot檢測Tet1CD過表達(dá)細(xì)胞系中5hmC的含量

如圖3所示,與對照組相比,誘導(dǎo)組(+Dox)基因組中的5hmC信號顯著增加,P＜0.001。說明構(gòu)建的細(xì)胞系中Tet1蛋白具有催化產(chǎn)生5hmC的功能。

圖1 重組質(zhì)粒構(gòu)建及酶切驗(yàn)證Note.A,Illustration of recombinant plasmid.B,Electrophoresis result of plasmid after double digestion by NotI and SfaAI(M,DNA marker.lane 1,double digestion of skeleton plasmid.lane 2,double digestion of recombinant plasmid.lane 3,double digestion of target fragment plasmid).Figure 1 Construction of recombinant plasmid and verification by enzyme digestion

圖2 Western blot檢測Tet1CD蛋白表達(dá)Note.A,Tet1 antibody staining diagram on the left,and TGX Stain-FreeTM FASTCASTTM Acrylamide Kit prepared total protein staining diagram on the right.B,Compared with the non-induced group,***P＜0.001.Figure 2 Detection of Tet1CD protein expression via Western blot

圖3 DNA Dot blot檢測基因組中的5hmC含量Note.The left,Methylene blue staining of fold-diluted DNA in control and induction groups.The right,5hmCsignal of fold-diluted DNA in control and induction groups.B,Compared with the non-induced group,***P＜0.001.Figure 3 Detection of 5hmC content in the genome via DNA Dot blot

2.4 Tet1CD過表達(dá)對細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡及的影響

2.4.1 Tet1蛋白對細(xì)胞增殖的影響

如圖4所示,陰性對照組(HEK293T+Dox)與空白對照組(HEK293T)間細(xì)胞增殖無顯著差異(P=0.83)。但,與陰性對照組(HEK293T+Dox)比,Tet1蛋白過表達(dá)對細(xì)胞增殖有明顯抑制作用(P＜0.0001)。說明Tet1蛋白對細(xì)胞增殖具有抑制作用。

2.4.2 Tet1蛋白對細(xì)胞周期的影響

如圖5A所示,實(shí)驗(yàn)組HEK(293T)+Dox周期中G2期占比為 25.47%,空白對照組 HEK293T為20.43%,陰性對照組HEK293T+Dox為20.69%。與空白對照組和陰性對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的G2期分別增加了24.67%和23.11%(圖中顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。如圖5B所示,為實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后的統(tǒng)計結(jié)果,與兩對照組相比,實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞周期阻滯在G2期(P＜0.05),而G1、S期未見顯著差異。

2.4.3 Tet1蛋白對細(xì)胞凋亡的影響

如圖6A左上所示,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞不經(jīng)任何染色在流式細(xì)胞術(shù)檢測凋亡的為FITC陰性,7AAD陰性(FITC-,7AAD-)的范圍,說明細(xì)胞中RFP的表達(dá)不會影響細(xì)胞凋亡的檢測。如圖6A所示,空白對照組(圖6A右上)、陰性對照組和實(shí)驗(yàn)組的早期凋亡(FITC+,7AAD-)有明顯差異,比例分別為1.39%、0.85%和2.83%,但是晚期凋亡無明顯變化。與陰性對照組相比,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞早期凋亡比例增加232.94%;而與空白對照組相比,Tet1蛋白過表達(dá)的細(xì)胞早期凋亡比例增加103.60%(圖中顯示單次實(shí)驗(yàn)結(jié)果)。如圖6B所示,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次后,實(shí)驗(yàn)組早期凋亡比例較陰性對照組和空白對照組顯著升高(P＜0.05)。說明Tet1蛋白對于細(xì)胞早期凋亡具有促進(jìn)作用。

3 討論

表觀遺傳學(xué)調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后。表觀遺傳學(xué)包括DNA甲基化、基因組印跡、組蛋白修飾等哺乳動物細(xì)胞基因組中的胞嘧啶甲基化是在表觀遺傳學(xué)中是代表性修飾,主要發(fā)生在CpG島,其甲基化水平往往與基因的轉(zhuǎn)錄活性呈負(fù)相關(guān)[17]。Tet1蛋白是Tet蛋白家族中的重要成員之一,參與介導(dǎo)DNA去甲基化的過程,在胚胎發(fā)育、骨髓造血及生殖細(xì)胞生成等過程中有著重要作用[18-19]。

Tet蛋白的CD結(jié)構(gòu)域是靠近羧基端的催化結(jié)構(gòu)域,具有氧化活性,能將5-甲基胞嘧啶(5mC)轉(zhuǎn)變?yōu)?-羥甲基胞嘧啶(5hmC),進(jìn)一步依次氧化成5-醛基胞嘧啶(5fC),5-羧基胞嘧啶(5CaC)[20]。據(jù)多篇文獻(xiàn)報道[8,11,21-25],Tet蛋白氧化5mC產(chǎn)生的中間體5hmC,其水平的高低與多種腫瘤,如血液惡性腫瘤、胃癌、前列腺癌、肝癌及結(jié)腸癌等有著密切的關(guān)系。結(jié)合Tet蛋白的氧化功能和5hmC與腫瘤的關(guān)系,提示可通過調(diào)節(jié)Tet氧化活性改變5hmC含量,降低DNA甲基化水平,從而改變腫瘤的發(fā)展進(jìn)程。

圖4 細(xì)胞計數(shù)法檢測Tet1蛋白對于細(xì)胞增殖的影響Note.Compared with the blank control group and the negative control group,****P＜0.0001.Figure 4 Detection of the effect of Tet1 protein on cell proliferation by cell counting

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測Tet1蛋白對細(xì)胞周期的影響Note.A,The effect of Tet1 protein on thecycle wasdetected by flow cytometry.B,Proportion of each period in cell cycle.Compared with the blank control group and the negative control group,*P＜0.05.Figure 5 Effect of Tet1 protein on cell cycle by flow cytometry

圖6 流式細(xì)胞術(shù)檢測Tet蛋白對細(xì)胞凋亡的影響Note.A,Top left,Cells in the experimental group were directly adjusted without fluorescence staining for apoptosis by staining with apoptotic reagent.Top right,Apoptosis in the blank control group.Bottom left,Apoptosis in the negative control group.Bottom right,Apoptosis in test group.B,Proportion of early apoptotic cells among different groups.Compared with the blank control group and the negative control group,*P＜0.05.Figure 6 Effect of Tet protein on apoptosis by flow cytometry

本研究通過在HEK293T細(xì)胞上構(gòu)建了誘導(dǎo)型Tet1CD過表達(dá)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系,用 Western blot和DNA dot blot方法在蛋白水平和生物學(xué)功能水平上鑒定穩(wěn)轉(zhuǎn)系的建立,結(jié)果顯示穩(wěn)轉(zhuǎn)系構(gòu)建成功并且Tet1蛋白具有催化產(chǎn)生5hmC的功能。通過細(xì)胞計數(shù)的方法觀察到Tet1蛋白對于細(xì)胞增殖具有抑制作用。之前有研究發(fā)現(xiàn),Tet蛋白家族中的Tet2能夠抑制細(xì)胞增殖[26],暗示Tet家族蛋白可能在細(xì)胞增殖過程中具有保守的作用,但是Tet家族蛋白影響細(xì)胞增殖是否依賴于其催化5hmC的功能還需要進(jìn)一步的研究。為了探討Tet1蛋白影響細(xì)胞增殖的機(jī)制,本研究通過流式細(xì)胞術(shù)方法發(fā)現(xiàn)Tet1蛋白導(dǎo)致G2時期的細(xì)胞比例增加,而G1和S期未見顯著差異,說明Tet1蛋白可能通過抑制細(xì)胞周期使細(xì)胞處于G2時期最終導(dǎo)致細(xì)胞增殖變慢。另外,本研究還發(fā)現(xiàn)Tet1蛋白促進(jìn)細(xì)胞早期凋亡,凋亡的細(xì)胞可能最終發(fā)生死亡,從而也會影響到細(xì)胞增殖的速度。

由于HEK293是胚胎腎永生化的細(xì)胞系,具有高度異常的核型,并組成性表達(dá)Ad5 E1A/E1B蛋白,從而抑制 pRB/p53通路。高度傳代下的HEK293細(xì)胞可誘導(dǎo)裸鼠腫瘤的形成[27]。而HEK293T細(xì)胞系作為HEK293細(xì)胞衍生物,區(qū)別在于其穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了編碼SV40大T抗原溫度敏感型突變體質(zhì)粒,因此更具致瘤性[28]。

綜上所述,本文通過在類癌細(xì)胞系HEK293T中過表達(dá)Tet1蛋白的結(jié)果可知,Tet1蛋白促進(jìn)對HEK293T細(xì)胞凋亡、促使細(xì)胞阻滯在G2時期,抑制細(xì)胞增殖,提示了通過調(diào)節(jié)Tet蛋白對細(xì)胞生長有著重要的意義。一方面,通過調(diào)節(jié)Tet蛋白的表達(dá),改變細(xì)胞的增殖速度,可能有利于細(xì)胞在體外高效擴(kuò)增。另一方面,通過調(diào)節(jié)Tet蛋白的表達(dá)可能會控制細(xì)胞的增殖速度和凋亡狀態(tài),從而延緩腫瘤的發(fā)展,或?yàn)槟[瘤治療的靶點(diǎn)之一。但是,如何在腫瘤細(xì)胞中精確的控制Tet1蛋白表達(dá)以及Tet1蛋白如何影響細(xì)胞增殖的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的闡明。