張 雨郭中坤付 彬雷 戰(zhàn)聶愛蕊莊峰鋒王可洲*

(1.濟南大學/山東省醫(yī)學科學院醫(yī)學與生命科學學院,濟南 250200;2.山東省實驗動物中心,山東第一醫(yī)科大學(山東省醫(yī)學科學院),濟南 250002)

殺菌/通透性增加蛋白(bactericidal/permeability-increasing protein,Bpi),最早在1978年由英國科學家Weiss等[1]在人中性粒細胞中分離純化而得到,存在于人、牛、豬等哺乳動物嗜中性粒細胞中。成熟的Bpi是由456個氨基酸殘基組成的一種陽離子抗菌蛋白,由氨基端、羧基端和富含脯氨酸的21個氨基酸殘基形成的中間連接單位三部分組成,相對分子質量為55×103。其經胰蛋白酶水解,可裂解為30×103的氨基部分和20×103的羧基部分[2]。這兩個部分在殺菌過程中所承擔的角色也不相同[3]：氨基部分主要起殺菌作用,而羧基部分起調理素的作用,可促使吞噬細胞吞噬入侵的細菌。研究發(fā)現(xiàn),Bpi兼具有廣譜殺傷革蘭氏陰性菌和中和內毒素的作用[4],其主要生物學功能為協(xié)助嗜中性粒細胞抑制細菌生長,發(fā)揮抗感染免疫保護作用[5]。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)是近年來興起的一種新型基因編輯技術。它是一種原核生物免疫系統(tǒng),被用來抵抗噬菌體病毒和外源質粒等外來遺傳物質的入侵[6]。它能夠識別并切斷外源DNA[7],正是由于如此精確的靶向功能,使得外源基因的表達被沉默。CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因編輯過程中主要依賴于sgRNA和靶序列DNA的互補配對[8]。因此,只需要根據目標基因靶點識別的前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif,PAM)設計一段20～24 bp的引物序列sgRNA,識別并結合到基因序列上,Cas9核酸內切酶就會在靶序列位置切割基因序列,從而會引起自身修復系統(tǒng)對DNA進行修復[9],如同源重組修復機制(homology directed repair,HDR)或非同源末端連接修復機制(non-homologous end joining,NHRJ),最終使基因組DNA缺失、插入或發(fā)生移碼突變[10],從而對目的基因進行有效的敲除、敲入或修飾等,完成基因編輯。通過編輯小鼠受精卵細胞的基因[11],并引入代孕母鼠體內,從而實現(xiàn)基因編輯小鼠模型的構建。2013年初,已有實驗組[12]將CRISPR/Cas9技術成功地運用在小鼠和人細胞中并實現(xiàn)了精確的基因編碼,隨之而來的便是CRISPR/Cas9技術的迅速發(fā)展,其在基因編輯領域發(fā)揮著巨大的發(fā)展?jié)摿Α?/p>

本研究利用CRISPR/Cas9技術剪切 Bpi蛋白的基因編碼區(qū),小鼠受精卵細胞通過NHEJ的DNA修復,在蛋白編碼區(qū)產生片段刪除,使得Bpi蛋白失活,從而實現(xiàn)Bpi基因敲除的目的。成功構建的Bpi基因敲除小鼠為后續(xù)研究其基因生物學功能及其機制提供了動物模型。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6雌鼠30只,體重14～15 g,4周齡;SPF級C57BL/6雄鼠15只,體重20～21 g,8～12周齡;SPF級ICR結扎雄鼠15只,體重26～28 g,8～12周齡;SPF級ICR雌鼠15只,體重30～32 g,8～12周齡,均購自北京唯尚立德生物科技有限公司[SCXK(京)2016-0009]。本研究實驗動物先后在北京唯尚立德生物科技有限公司[SYXK(京)2016-0039]和山東省實驗動物中心[SYXK(魯)2019-0007]IVC籠具內飼養(yǎng)。經山東省實驗動物中心審批(20181224-01),并嚴格遵循實驗動物使用的3R原則。

1.2 主要試劑與儀器

金牌mix(green)(北京擎科生物科技有限公司,LOT：TSE101);引物序列合成(上海生工生物工程有股份限公司合成,LOT：240038139);動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒(北京君諾德生物技術有限公司,LOT：0180331AX);Cas9 mRNA、Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒(北京唯尚立德生物科技有限公司,LOT：VK007);注射用人絨毛膜促性腺激素(hCG)(寧波第二激素廠,LOT：181223);注射用血促性素(PMSG)(寧波第二激素廠,LOT：1905152);OTOPO零背景PCR平末端克隆試劑盒(北京華恒健生物科技有限公司,LOT：HHK826);HiScribe T7 ARCA mRNA試劑盒(NEB公司,LOT：E2065S)。

體視顯微鏡(Nikon SMZ745T,日本);顯微注射用顯微鏡(Nikon ECLIPSE Ts2,日本);拉針儀(NARISHIGE PN-31,日本);PCR擴增儀(Eppendorf Mastercycler 50x,德國);高速冷凍離心機(Eppendorf 5424R,德國);水平電泳儀(北京君意 JY600C,中國);凝膠成像系統(tǒng)(UVP EC3Chemi,美國)等。

1.3 實驗方法

1.3.1 根據Bpi序列結構,分析CRISPR/gRNA靶點設計位置

通過NCBI和Ensembl網站查詢當前Bpi基因數(shù)據(NCBI：Gene ID：329547,Ensembl,Gene：BpiENSMUSG00000052922),對其轉錄產物及其保守區(qū)域進行分析,以設計CRISPR/gRNA靶點設計位置。

1.3.2 sgRNA和Cas9 mRNA的體外轉錄與靶點活性檢測

使用北京唯尚立德Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒將設計的gRNA靶點體外轉錄成sgRNA并檢測轉錄產物活性,檢測原理及具體方法參見唯尚立德VK007試劑盒說明書。同時進行Cas9 mRNA的體外轉錄用于后續(xù)的顯微注射,具體方法參見NEB-E2065S試劑盒說明書。

1.3.3 小鼠超數(shù)排卵、受精卵注射以及胚胎移植

向預先準備好的4周齡左右的C57BL/6雌鼠腹腔注射血促性素和人絨毛膜促性腺激素,每只注射劑量約為5 U,兩次注射間隔48 h。在給藥18 h后,將注射激素后的C57BL/6雌鼠以及1只8～12周齡C57BL/6雄鼠處死,分別取出雌鼠的輸卵管膨大部以及雄鼠的附睪,在體視顯微鏡下分別收集卵子和精子。使精子在獲能液中獲能,取液體邊緣的精子滴加到短暫培養(yǎng)的卵細胞中,體外受精3～4 h。將體外轉錄成功的sgRNA與Cas9 mRNA分別用無RNA酶水稀釋到25 ng/μL和50 ng/μL,通過顯微注射的方式導入到小鼠受精卵細胞質中,將存活的狀態(tài)良好的受精卵移植到與結扎雄鼠合籠后見栓的ICR雌鼠輸卵管膨大部,縫合,將代孕雌鼠飼養(yǎng)于IVC環(huán)境。

1.3.4 F0代小鼠的基因型鑒定和DNA測序

F0代鼠出生后約一周齡剪取小鼠腳趾并編號,使用動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒提取小鼠DNA。根據被敲除的序列位置設計鑒定用PCR擴增引物,基因敲除示意圖及引物信息分別如圖1、表1所示,PCR擴增體系及反應程序如表2所示。對PCR擴增產物進行T-A克隆(具體方法參見華恒建HHK826試劑盒說明書),并進行DNA測序。

表1 引物名稱及其序列Table 1 Primer name and sequence

表2 PCR擴增體系及反應程序Table 2 PCR amplification system and reaction procedure

1.3.5 F0代小鼠的飼養(yǎng)與擴繁

經過對F0代小鼠的基因型鑒定及DNA測序,篩選出成功發(fā)生基因突變的陽性首建鼠與C57BL/6野生型小鼠進行交配,待F1代小鼠出生后,再次利用上述鑒定方法對敲除情況進行鑒定,篩選出敲除情況相同且性別不同的F1代小鼠進行近交,F2代小鼠繼續(xù)進行基因型鑒定,以建立穩(wěn)定遺傳Bpi基因型敲除小鼠品系。

2 結果

2.1 CRISPR/gRNA靶點設計

查詢Bpi基因組數(shù)據得,該基因存在3個轉錄產物,且對Bpi基因的蛋白功能保守區(qū)域進行分析,如圖2、圖3所示。根據Bpi基因組結構和蛋白功能保守區(qū),選取Bpi-201進行設計,其中外顯子2和外顯子3(44～125 aa)為公共外顯子,蛋白編碼區(qū)的堿基數(shù)為244 bp是非3的倍數(shù),在保守功能區(qū)Bpisuperfamily的N端。在刪除外顯子2～3后mRNA重新剪拼形成新的mRNA,其編碼的蛋白將會發(fā)生移碼突變,使蛋白失活。因此決定在外顯子2和外顯子3的兩端設計靶點,如圖4所示。

根據Bpi基因組結構和蛋白功能保守區(qū),設計了如下gRNA靶點,如表3所示：

圖2 Bpi基因的3種轉錄途徑Note.The length of three transcription pathways(Bpi-201,202,203)is 486 aa,483 aa,482 aa,respectively,the difference region is located in exon 9-10(Ensembl,Gene,Bpi ENSMUSG00000052922).Figure 2 Three transcripts of Bpi gene

圖3 Bpi基因的保守區(qū)域Note： Exon 2～3(130～373 bp)is located in the N-terminal of the conservative BPI superfamily(106～777 bp).Figure 3 Conservative domain of Bpi gene

圖4 轉錄產物Bpi-201的基因組結構Note.The green arrows indicate the cutting positions of gRNA targets.Figure 4 Genome structure of transcription product Bpi-201

2.2 高活性Cas9/gRNA敲除靶點篩選

使用Cas9/gRNA靶點效率檢測試劑盒檢測以上設計的gRNA靶點活性,Cas9/gRNA體外酶切結果及gRNA靶點活性數(shù)據分析如圖5所示。靶點活性評價標準詳見唯尚立德VK007試劑盒說明書。根據體外酶切結果分析得出：除Bpi-L5、Bpi-R1、Bpi-R2、Bpi-R3外,gRNA靶點的活性均在85%以上。我們選擇Bpi-L4、Bpi-R4一對gRNA靶點進行體外轉錄用于小鼠受精卵的注射。

2.3 F0代小鼠的鑒定及子代繁育

顯微注射后,收獲了64枚受精卵,將這些卵移植至2只見栓代孕ICR雌鼠的雙側輸卵管膨大部。待其生產后,共獲得F0代仔鼠22只,對其進行基因型鑒定和DNA測序后,選取一只單鏈缺失708 bp堿基的陽性首建鼠3號雄鼠,其PCR鑒定結果及TA克隆測序峰圖如圖6所示。將3號雜合子陽性首建鼠與C57BL/6野生型小鼠進行交配,所得8只F1代仔鼠基因型PCR鑒定結果如圖7所示,突變型小鼠電泳結果在550 bp位置出現(xiàn)清晰條帶,且測序結果分析得出同樣堿基缺失708 bp,證明該缺失可被穩(wěn)定遺傳(在F和R一對引物用于雜合子小鼠的鑒定過程中,由于PCR條件的原因出現(xiàn)1258 bp野生型條帶的情況是偶然性的,說明F和R這對引物不適合用于雜合子小鼠的野生型鑒定,故單獨設計WT-R用來做野生型鑒定)。F1代雜合子小鼠間進行近交。出生的11只F2代小鼠中,有4只小鼠出現(xiàn)清晰突變型條帶,并且未出現(xiàn)野生型條帶,且PCR擴增產物測序結果表明同樣堿基缺失708 bp,證明成功獲得F2代Bpi基因敲除純合子小鼠,基因型PCR鑒定結果如圖8所示,F1代和F2代小鼠基因型總數(shù)統(tǒng)計結果如表4所示。

3 討論

3.1 Bpi基因敲除小鼠遺傳穩(wěn)定品系的建立

本研究利用Cas9技術最終獲得22只F0代小鼠。通過基因型鑒定及DNA測序的方式進行篩選,最終獲得5只基因片段刪除的F0代陽性首建鼠。為了確保產生的基因突變能夠穩(wěn)定遺傳,將F0代小鼠與同品系同背景的野生型小鼠進行交配,選擇其中穩(wěn)定產生基因突變的后代進行下一步的繁育。該實驗為了獲得盡可能多的Bpi基因敲除小鼠用于下一步的實驗研究,將性成熟的F1代陽性鼠之間進行近交,獲得F2代小鼠,其中包括4只Bpi基因敲除純合子小鼠。將F2代陽性小鼠之間雄鼠與雌鼠1∶2合籠,經過一段時間的飼養(yǎng)、繁殖與鑒定,目前已獲得了一定數(shù)量的Bpi基因敲除小鼠。這為深入研究Bpi基因的相關生物學功能及其機制提供了良好的實驗模型,對整體實驗研究的開展具有重要的意義。

3.2 CRISPR/Cas9技術基因敲除小鼠的脫靶風險

在現(xiàn)代醫(yī)藥生物領域中,借助CRISPR/Cas9基因編輯技術,構建基因敲除小鼠模型的試驗研究有很多,其作為一種新型的基因編輯工具,相較于傳統(tǒng)基因編輯技術具有操作便捷、低成本、高效率等優(yōu)點。然而,此系統(tǒng)存在的潛在脫靶風險仍需要謹慎對待。多項研究認為,sgRNA序列、PAM序列以及Cas9均為引起脫靶效應的可能性因素[13],且有研究發(fā)現(xiàn),通過增強sgRNA的特異性、控制Cas9-sgRNA的用量、優(yōu)化Cas9核酸酶或選擇合適的Cas9遞送載體等方法可以不同程度地降低脫靶效應。盡管如此,CRISPR/Cas9技術的脫靶問題仍然不能完全避免。因此,為保證成功構建出Bpi基因敲除小鼠模型,對基因敲除小鼠進行基因型PCR鑒定和DNA測序,這也是必不可少的一步。

表3 gRNA靶點名稱及序列Table 3 Name and sequence of gRNA target

圖5 Cas9/gRNA靶點活性檢測結果Note.A,Results of Cas9/gRNA enzyme digestion in vitro(NC is negative control).B,Analysis of activity data of gRNA target.Figure 5 Detection results of Cas9/gRNA target activity

圖6 Bpi敲除小鼠F0代仔鼠1-22號基因型鑒定結果及T-A克隆測序峰圖Note.A,Genotyping results showing the mutant strip indicated with red arrows(Primers,F and R,M,DL2000 Marker).B,Sequencing peak map of F0 offspring rat No.3 male(Base deletion,708 bp).Figure 6 Genotyping of 1-22 in F0 offspring of Bpi knockout mice and peak map of T-A cloning and sequencing

圖7 Bpi敲除小鼠F1代仔鼠1-8號基因型鑒定結果Note.Knockout identification shown by red arrow-indicated mutant strip(Primers,F and R)and WT identification(Primers,F and WT-R)on the left lanes 1-8 and right lanes 1-8,respectively.M,DL2000 Marker.Figure 7 Genotyping of 1-8 in F1 offspring of Bpi knockout mice

圖8 Bpi敲除小鼠F2代仔鼠1-11號基因型鑒定結果Note.Knockout identification shown by red arrow-indicated mutant strip(Primers,F and R)and WT identification(Primers,F and WT-R)on the left lanes 1-11 and right lanes 1-11,respectively.M,DL2000 Marker.Figure 8 Genotyping of 1-11 in F2 offspring of Bpi knockout mice

表4 子代鼠各基因型數(shù)量統(tǒng)計Table 4 The number of genotypes in offspring

3.3 Bpi基因敲除小鼠的表型變化

本研究所構建的Bpi基因敲除小鼠,純合子小鼠與野生型小鼠在毛色、胎仔數(shù)量、仔鼠8 W內存活率等表型方面均無明顯差異,通過提取Bpi基因敲除小鼠睪丸組織RNA,進行RT-PCR擴增,未見Bpi基因外顯子轉錄水平表達。Bpi基因敲除小鼠在mRNA水平、蛋白質水平表型鑒定及其免疫因子、激素水平方面的變化與數(shù)據分析,將在后續(xù)研究中進行更加深入的探討。經編輯后的Bpi基因在F1代基因組中實現(xiàn)穩(wěn)定的生殖系專遞,并在F2代中獲得純合子小鼠。純合子小鼠在毛色、外形等外觀表型上沒有明顯變化。

3.4 構建Bpi基因敲除小鼠的意義

Bpi作為一類殺菌性蛋白,其對革蘭氏陰性菌如大腸桿菌、沙門氏菌、志賀痢疾桿菌、綠膿桿菌、變形桿菌和奈瑟球菌等均有抑制和殺傷作用[14],關于Bpi的作用機制,目前研究解釋為帶正電荷的陽離子Bpi蛋白與革蘭氏陰性菌表面LPS(脂多糖)結合后,LPS在菌細胞膜上的正常排列被破壞,從而導致細胞滲透性顯著增強進而引起細菌細胞的裂解[15],使細菌的生長受到抑制甚至最終導致細菌裂解死亡。有研究發(fā)現(xiàn),Bpi不僅承擔殺菌作用和中和內毒素的作用,其對于促進傷口愈合也具有積極的作用[16]。另外,在正常情況下,Bpi在小鼠的睪丸和附睪中被檢測到高水平表達[17],這也提示了Bpi亦有可能對精子的發(fā)生與成熟等生殖功能具有影響作用。Bpi的殺菌機制及其它可能存在的未知生物學功能亟待被探索和發(fā)現(xiàn)。目前,在科學領域對Bpi的相關研究較少,本課題構建小鼠Bpi基因敲除小鼠模型,為今后對Bpi功能更為深入的探索和發(fā)現(xiàn)奠定了基礎。

3.5 Bpi——潛在的新型抗菌藥物

抗生素的濫用導致了大量耐藥菌株的出現(xiàn),尋找一類新型的特異性藥物來對抗某些耐藥菌已成為當務之急。有研究發(fā)現(xiàn),Bpi作為生物機體內一類能夠特異性殺傷革蘭氏陰性菌的抗菌性蛋白,將其主要發(fā)揮抗菌作用和結合內毒素功能的氨基端與其它生物活性因子結合,重組成一種新型的融合蛋白,有助于研制一類新型的抗菌多肽類藥物。目前已有報道對Bpi蛋白進行原核或真核重組表達[18-19],為開發(fā)出一種既能在促進傷口愈合的同時又能避免細菌感染的雙功能新型多肽類藥物打下基礎。另外,Bpi除用于治療革蘭氏陰性菌感染性疾病外,還被開發(fā)出一系列Bpi衍生肽,如抗真菌藥,抗血管形成類藥等。Bpi作為一類潛在的新型藥物,必然會在不久的將來被廣泛地應用于臨床醫(yī)學、農業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)等生物學領域,為許多疾病的治療帶來新的希望。