賈 鸝楊志宏馬俊利

(唐山職業(yè)技術(shù)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部,唐山 063300)

原發(fā)性肝癌為常見惡性腫瘤,具有起病隱匿、發(fā)展迅速、侵襲能力強等特征,患者一般預(yù)后較差,致死率極高,近年來發(fā)病率有升高趨勢,在腫瘤致死原因中占第2位[1]。手術(shù)切除是治療肝癌的首要方法,但切除率并不高,影響長期療效,因此有必要進行深入研究肝癌分子發(fā)生機制,對于肝癌的預(yù)防、治療具有十分重要的臨床意義。腫瘤血管新生及代謝增強,可進一步促進腫瘤的細胞增殖、侵襲、遷移,是造成腫瘤惡化的重要原因[2]。研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在肝癌中呈低表達,發(fā)揮抑癌基因的作用[3]。體外研究發(fā)現(xiàn)miR-200c可通過負調(diào)控鋅指蛋白(inc finger E-boxbinding protein,ZEB)參與腫瘤EMT過程,然而miR-200c/ZEB與肝癌血管形成的關(guān)系,目前尚不清楚[4]。貞芪扶正顆粒主要由女貞子、黃芪組成,具有提高免疫能力,及對骨髓、肝的保護作用,在腫瘤輔助治療中發(fā)揮重要作用,然而對肝癌血管形成的作用,目前尚不清楚,本研究制備肝癌模型大鼠,并給予貞芪扶正顆粒干預(yù),旨在探究其對肝癌大鼠血管形成的作用及可能的作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

76只3月齡雄性Wistar大鼠,體重(200±10)g,SPF級,購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2016-0011],飼養(yǎng)于華北理工大學(xué)動物房[SYXK(京)2017-0022];飼養(yǎng)室溫為 23℃ ～25℃,空氣相對濕度為50%～70%,飼養(yǎng)1周后用于模型制備。本研究獲得華北理工大學(xué)實驗動物福利與倫理委員會批準同意(IACUC20180419),并按實驗動物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

1.2 主要試劑與儀器

貞芪扶正顆粒購于甘肅扶正藥業(yè)科技股份有限公司,批號：20171214,規(guī)格：每袋15 g;二乙基亞硝銨(Diethyl ammonium nitrite,DEN)(N0258)購于美國Sigma公司;RIPA裂解液(P0013D)、HE染色試劑盒(C0105)購于碧云天生物技術(shù)研究所;免疫組化檢測試劑盒(I001-1)、血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)(H044)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,ALT)(C009-2-1)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(glutamic oxaloacetic transaminase,AST)(C010-2-1)檢測試劑盒購于南京建成生物工程研究所;RNA提取試劑盒(R1200)購自北京索萊寶公司;實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)檢測試劑盒(KK4652)購于Sigma-Aldrich公司;兔抗鼠ZEb-2(ab138222)、VEGF抗體(ab53465)、山羊抗兔HRP標記二抗(ab205719)購于英國Abcam公司;兔抗鼠CD34(3569)、β-actin抗體(3700)購自美國CST公司;ELX800自動酶標儀購于美國BioTECK公司;IPSE55I光學(xué)顯微鏡購于日本尼康公司;Sysmex CHEMIX800型全自動生化分析儀購自日本希森美康公司;ChemiDoc XRS凝膠成像儀購于美國Bio-Rad公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物模型制備

隨機挑選64只大鼠進行肝癌模型復(fù)制,參照間斷小劑量DEN誘導(dǎo)肝癌大鼠法造模[5],腹腔注射0.2%DEN大鼠(20 mg/kg),每周給藥3次,持續(xù)4周,隨后停藥2周,第7周開始灌胃大鼠0.01%DEN,持續(xù)4周,第11周灌胃0.02%DEN,14周結(jié)束喂養(yǎng)。隨機選取2只大鼠處死后,切除瘤組織進行病理組織學(xué)檢測造模是否成功。排除死亡大鼠,共48只大鼠造模成功,造模成功率為75.00%。另設(shè)12只大鼠作為對照組(Control),不進行任何處理。

1.3.2 動物分組與給藥

造模后將大鼠分為Model組、貞芪扶正顆粒組、si-miR-200c組、貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組,每組12只大鼠。貞芪扶正顆粒組：造模結(jié)束后給藥貞芪扶正顆粒,參考文獻[6],劑量為2.62 g/kg。si-miR-200c組：造模結(jié)束后注射20 pm si-miR-200c,參考文獻[7],劑量為20 pm。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組：造模結(jié)束后用1 mL無菌注射器尾靜脈注射20 pm si-miR-200c,隨后給藥貞芪扶正顆粒,劑量為2.62 g/kg。 Control、Model組灌胃等量生理鹽水,各組均連續(xù)處理8周。

1.3.3 觀察指標與檢測方法

(1)樣本收集

末次處理后將大鼠麻醉后處理,沿腹中將腹腔剪開,游離腸系膜和腸管,暴露主動脈后抽取2 mL腹主動脈血,5000 r/min離心15 min,置于-20℃保存。血液采集后,迅速獲取肝組織,切除部分肝組織放置在4%多聚甲醛溶液中固定,另外一部分肝組織置于-80℃保存。

(2)血清 VEGF、ALT、AST 水平檢測

采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中VEGF水平,具體參考試劑盒說明書進行操作。ALT、AST水平用全自動生化儀測定。

(3)HE染色觀察大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化情況

取出固定肝組織,沖洗后在分級乙醇溶液中脫水后,置于二甲苯中透明處理,石蠟包埋后,制備6μm厚度組織切片,60℃烘烤后經(jīng)二甲苯脫蠟、分級乙醇脫水后采用蘇木素染液對切片染色5 min,清水沖洗后置于1%鹽酸乙醇中30 s,沖洗后采用伊紅染液復(fù)染2 min,經(jīng)脫水、透明、封片后置于光鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化情況。

(4)qRT-PCR法檢測肝組織中miR-200c表達

采取RNA提取試劑盒提取肝組織中總RNA,參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄后為cDNA,配制25μL擴增體系：上下游引物分別為1.25μL,cDNA 2μL,2×SYBR Green反應(yīng)液 12.5μL,無 RNA酶水 5.5 μL。反應(yīng)程序參數(shù)：95℃預(yù)變性15 min,94℃ 15 s,55℃ 30 s,40個循環(huán),每個樣本設(shè)定三個重復(fù)孔,采用2-ΔΔCt法計算肝組織中 miR-200c表達量。miR-200c上游引物序列：5’-GCCCGCTAATACTGCCG GGTA-3’;下游引物序列：5’-CAGTGCTGGGTCC GAGT-3’。 內(nèi)參 U6 上游引物序列：5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’;下游引物序列：5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’。

(5)免疫印跡法檢測肝組織中ZEb-2、VEGF蛋白表達

取出保存肝組織,剪碎后添加RIPA裂解液裂解組織,5000 r/min離心20 min后,利用BCA試劑盒檢測組織蛋白總濃度,經(jīng)SDS-PAGE電泳后分離目的蛋白,濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上,添加封閉液封閉后,將膜與兔抗鼠ZEb-2、VEGF、β-actin一抗抗體(1∶300)在4℃環(huán)境中過夜,次日室溫下添加二抗(1∶5000)孵育1 h,清洗后避光顯影,在凝膠成像儀內(nèi)觀察蛋白條帶,并采用Image-J軟件定量分析各個蛋白相對表達量。

(6)免疫組化檢測檢測肝組織中ZEb-2、VEGF、MVD陽性表達率

肝組織石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化后,加入 3%H2O2滅活過氧化物酶活,熱抗原修復(fù)后,用10%山羊血清封閉抗原,添加ZEb-2、VEGF、CD34一抗(1∶500),室溫下放置2 h后,置于4℃冰箱內(nèi)孵育過夜,室溫下添加二抗孵育1 h,避光下添加DAB顯色液顯色5 min,置于顯微鏡下觀察蛋白染色情況。ZEb-2陽性：細胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或黃色顆粒為陽性;VEGF、MVD：細胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色顆粒為陽性。利用Image-J軟件定量分析陽性表達率,陽性表達率=染色陽性細胞數(shù)/細胞總數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

本研究數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進行分析。計量資料以平均數(shù)±標準差(±s)描述,多組間比較行單因素方差分析,進一步兩兩對比采用SNK-q檢驗,當P＜0.05時,則差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況比較

Control組大鼠飲食、精神狀態(tài)、活動均正常;Model組大鼠進食量減少,精神萎靡,毛發(fā)蓬亂。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組大鼠狀態(tài)得到一定的改善,si-miR-200c組大鼠狀態(tài)更差,貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組變化不顯著。末次處理結(jié)束后,si-miR-200c組大鼠存活率最低,Control組大鼠生存率為100%,見表1。

表1 各組大鼠生存情況比較Table 1 Comparison of survival status of each group of rats

2.2 各組大鼠血清中VEGF及肝功能指標變化情況

與 Control組相比,Model組 VEGF、ALT、AST 水平升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組 VEGF、ALT、AST 水平降低,si-miR-200c組VEGF、ALT、AST 水平升高(P＜0.05)。 貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組 VEGF、ALT、AST水平低于 simiR-200c組(P＜0.05),見表 2。

2.3 HE染色觀察大鼠肝病理形態(tài)學(xué)變化情況

Control組肝組織細胞核染色清晰,細胞排列整齊;Model組癌細胞出現(xiàn)較明顯變形,細胞核變大,核質(zhì)比例增大,核仁染色不明顯,較多細胞核出現(xiàn)分裂,細胞排列彌散不規(guī)則,伴有變性、壞死及炎性細胞浸潤。貞芪扶正顆粒組肝組織細胞變形程度減輕,伴有少部分壞死細胞,癌細胞分化程度較高,炎性浸潤程度降低;而si-miR-200c癌細胞明顯增多,細胞變形增加,分化程較低,出現(xiàn)大量壞死、變形、炎性細胞。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組細胞變形、壞死數(shù)量有所減少,但與Model組相比無顯著性變化,見圖1。

表2 各組大鼠血清VEGF、ALT、AST水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum VEGF,ALT,AST levels in each group

表2 各組大鼠血清VEGF、ALT、AST水平比較(±s)Table 2 Comparison of serum VEGF,ALT,AST levels in each group

注：與Control組相比,*P＜0.05;與Model組相比,#P＜0.05;與貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組相比,a P＜0.05。Note.Compared with control group,*P＜0.05.Compared with model group,#P＜0.05.Compared with Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c Group,a P＜0.05.

組別Groups n 血管內(nèi)皮生長因子(ng/L)VEGF谷丙轉(zhuǎn)氨酶(U/L)ALT谷草轉(zhuǎn)氨酶(U/L)AST Control組Control group 12 18.13±2.44 65.38±7.87 96.13±10.75 Model組Model group 8 283.19±31.36* 251.51±26.16* 285.46±33.23*貞芪扶正顆粒組Zhenqi Fuzheng granules group 10 225.28±33.25*#a 176.14±24.25*#a 161.16±27.36*#a si-miR-200c組si-miR-200c group 6 321.41±35.07*#a 284.86±25.36*#a 322.47±22.94*#a貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group 8 275.32±36.27* 246.08±31.28* 272.97±25.19*

圖1 HE染色觀察大鼠肝組織病理形態(tài)情況Figure 1 Observe the pathological morphology of rat liver tissue by HE staining

2.4 貞芪扶正顆粒對肝組織中ZEB/miR-200c通路與VEGF表達的影響

與Control組相比,Model組 miR-200c表達降低,ZEb-2、VEGF蛋白表達升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組miR-200c表達升高,ZEb-2、VEGF蛋白表達降低,si-miR-200c組miR-200c表達降低,ZEb-2、VEGF蛋白表達升高(P＜0.05)。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組miR-200c表達高于si-miR-200c組,ZEb-2、VEGF蛋白表達低于 si-miR-200c組(P＜0.05),見圖2、表3。

2.5 貞芪扶正顆粒對肝組織中ZEb-2表達的影響

與Control組相比,Model組ZEb-2陽性表達率升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組ZEb-2陽性表達率降低,si-miR-200c組ZEb-2陽性表達率升高(P＜0.05)。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組ZEb-2陽性表達率低于 si-miR-200c組(P＜0.05),見圖 3、表 4。

圖2 免疫印跡法檢測大鼠肝組織ZEb-2、VEGF蛋白表達情況Note.A,Control group.B,Model group.C,Zhenqi Fuzheng granules group.D,si-miR-200c group.E,Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group.Figure 2 Detection of ZEb-2 and VEGF protein expression in rat liver tissue by Western blot

表3 各組肝組織中miR-200c、ZEb-2、VEGF表達比較(±s)Table 3 Comparison of miR-200c,ZEb-2,and VEGF expression in liver tissue of each group

表3 各組肝組織中miR-200c、ZEb-2、VEGF表達比較(±s)Table 3 Comparison of miR-200c,ZEb-2,and VEGF expression in liver tissue of each group

注：與Control組相比,*P＜0.05;與Model組相比,#P＜0.05;與貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組相比,a P＜0.05。Note.Compared with Control group,*P＜0.05.Compared with Model group,#P＜0.05.Compared with Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group,a P＜0.05.

Control組Control group 12 1.05±0.13 0.22±0.04 0.28±0.03 Model組Model group 8 0.42±0.05* 0.72±0.09* 0.66±0.07*貞芪扶正顆粒組Zhenqi Fuzheng granules group 10 0.64±0.09*#a 0.41±0.05*#a 0.39±0.05*#a si-miR-200c組si-miR-200c group 6 0.27±0.05*#a 0.84±0.08*#a 0.79±0.09*#a貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組Zhenqi Fuzheng granules+si-miR-200c group 8 0.40±0.07* 0.69±0.07* 0.68±0.08*

圖3 免疫組化檢測肝組織ZEb-2陽性表達Figure 3 ZEb-2 positive expression in liver tissue detected by immunohistochemistry

2.6 貞芪扶正顆粒對肝組織中VEGF、微血管密度(MVD)表達的影響

與Control組相比,Model組VEGF、MVD陽性表達率升高(P＜0.05)。與Model組相比,貞芪扶正顆粒組VEGF、MVD陽性表達率降低,si-miR-200c組VEGF、MVD陽性表達率升高(P＜0.05)。貞芪扶正顆粒+si-miR-200c組VEGF、MVD陽性表達率低于si-miR-200c組(P＜0.05),見圖4、表5。

表4 各組肝組織中ZEb-2陽性表達比較Table 4 Comparison of ZEb-2 positive expression in liver tissue of each group

圖4 免疫組化檢測肝組織VEGF、MVD陽性表達Figure 4 Immunohistochemical detection of positive expression of VEGF and MVD in liver tissue

表5 各組肝組織中VEGF、MVD陽性表達比較Table 5 Comparison of positive expression of VEGF and MVD in liver tissue of each group

3 討論

DEN為亞硝基化學(xué)致毒劑,進而機體后能夠使DNA雙鏈編碼錯誤,進而導(dǎo)致肝癌形成[8]。本研究采用改良DEN誘導(dǎo)法,結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組肝組織多數(shù)細胞壞死,伴有炎性細胞浸潤,細胞不典型增生,發(fā)生水腫、纖維化,排列不規(guī)則,呈團狀或索狀,彌漫性分組在組織中,這與肝癌病理學(xué)檢測結(jié)果相符[9]。血清檢測發(fā)現(xiàn)模型組肝功能指標ALT、AST水平顯著升高,表明模型大鼠肝功能受損,進一步提示肝癌模型大鼠復(fù)制成功。

貞芪扶正顆粒主要由黃芪與女貞子兩味中藥材組成,藥理學(xué)研究顯示其可保護骨髓與腎上腺皮質(zhì)功能,提高機體免疫力[10]。文獻報道顯示其中主要藥材黃芪能夠抑制肝癌細胞的增殖,通過下調(diào)MMP-2、bFGF的表達抑制肝癌新生血管的形成[11]。動物研究發(fā)現(xiàn)貞芪扶正顆?？擅黠@降低大鼠炎癥反應(yīng),緩解肝纖化程度[12]。以上研究均提示貞芪扶正顆粒對肝疾病具有一定的治療作用。本研究發(fā)現(xiàn)與Model組相比,貞芪扶正顆粒組肝組織細胞壞死程度、炎性浸潤程度均減輕,肝功能指標ALT、AST水平顯著降低,推測貞芪扶正顆粒能夠改善肝癌大鼠肝組織損傷及肝功能障礙。

惡性腫瘤的增殖具有顯著的血管生成依賴性,新生血管也是腫瘤迅速增殖的形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。VEGF作為血管生成刺激因子可與內(nèi)皮細胞特定受體結(jié)合,進而刺激內(nèi)皮細胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤血管新生。過往研究發(fā)現(xiàn)VEGF為強烈的血管發(fā)生蛋白,能夠制劑刺激、趨化內(nèi)皮細胞,促進肝癌等其它多種腫瘤血管形成[13]。文獻報道MVD為評定腫瘤血管形成的金標準,與腫瘤的浸潤及轉(zhuǎn)移有著密切關(guān)系,肝癌腫瘤血管生成在肝癌的發(fā)展中具有重要作用,通過測定肝癌MVD能夠反應(yīng)肝癌的血管生成狀況[14]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Model組肝組織中VEGF蛋白表達顯著升高,且VEGF、MVD陽性表達率明顯升高,經(jīng)貞芪扶正顆粒干預(yù)后VEGF、MVD陽性表達率顯著降低,推測貞芪扶正顆粒對肝癌新生血管具有一定的抑制作用。

miR-200c為miR-200家族成員之一,定位在12號染色體,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān),通過調(diào)控靶基因如ZEb-1、ZEb-2等表達進而影響腫瘤細胞侵襲、遷移、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化進程[15-16]。既往研究發(fā)現(xiàn)miR-200c在多種腫瘤中均下調(diào)表達,如miR-200c通過靶向kras抑制乳腺癌的增殖[17]。Zhou等[18]研究發(fā)現(xiàn)miR-200c通過靶向ZEb-1抑制非小細胞肺癌、增殖、侵襲、遷移。近期在肝癌患者中研究發(fā)現(xiàn)肝癌患者血清中miR-200c表達明顯低于正常者,且與患者發(fā)生肝轉(zhuǎn)移有關(guān)[19]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Model組肝組織中miR-200c表達明顯降低,經(jīng)貞芪扶正顆粒干預(yù)后miR-200c表達升高,推測miR-200c在肝癌發(fā)正中發(fā)揮抑癌作用。司青樂等[20]研究發(fā)現(xiàn)腎透明細胞癌中過表達miR-200c,可顯著降低ZEb-2表達,推測兩者以負調(diào)控關(guān)系參與腎癌的發(fā)生。在胃癌細胞中上調(diào)miR-200c可降低ZEb-2表達進而抑制細胞EMT過程[21]。本研究發(fā)現(xiàn)與Control組相比,Model組肝組織中ZEb-2表達明顯升高,經(jīng)貞芪扶正顆粒干預(yù)后ZEb-2表達降低,結(jié)合以上報道推測miR-200c、ZEb-2可能以負調(diào)控參與肝癌的發(fā)生,為進一步證實肝癌中兩者的關(guān)系,本研究采用si-miR-200c干預(yù)肝癌模型,發(fā)現(xiàn)肝癌大鼠肝組織細胞壞死程度、炎性浸潤程度增加,癌細胞分化程度降低,而肝組織中VEGF、MVD表達升高,ZEb-2蛋白表達升高,推測miR-200c可能通過負調(diào)控ZEb-2促進肝癌新生血管形成,進而加速肝癌細胞惡化。而貞芪扶正顆粒聯(lián)合si-miR-200c干預(yù)后,與si-miR-200c組相比,肝組織細胞損傷程度降低,VEGF、MVD、ZEb-2蛋白表達降低,推測貞芪扶正顆?？赡芡ㄟ^上調(diào)miR-200c表達,負調(diào)控ZEb-2表達,進而抑制肝癌血管形成及肝癌的進展。

綜上所述,貞芪扶正顆粒能夠改善肝癌模型大鼠肝組織損傷,保護肝功能、抑制腫瘤血管形成,其可能是通過調(diào)控miR-200c/ZEB通路實現(xiàn)的。然而本研究僅從動物模型探究貞芪扶正顆粒對肝癌血管新生的抑制作用,其具體機制尚不明確,還有待采用細胞實驗內(nèi)進一步驗證。