鄭蒙蒙，施建棟，周海霞

（1.溫州醫(yī)科大學(xué) 科研實(shí)驗(yàn)中心 流式細(xì)胞技術(shù)平臺(tái)，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院 兒童血液科，浙江 溫州 325027）

免疫性血小板減少癥（immune thrombocytopenia，ITP）是兒童常見(jiàn)的出血性疾 病[1]，病情嚴(yán)重的患兒可發(fā)生內(nèi)臟甚至顱內(nèi)出血而危及生命，病死率為1%～3%[1-2]。ITP的病因多樣，機(jī)體免疫耐受狀態(tài)的失衡是導(dǎo)致該病發(fā)生的重要機(jī)制，其中由血小板受體與T細(xì)胞受體的相互交叉免疫反應(yīng)引發(fā)T/B細(xì)胞針對(duì)自身抗原的異?；罨?，而觸發(fā)一系列免疫反應(yīng)，并最終引發(fā)ITP的相關(guān)機(jī)制研究較多[2-3]。此外，感染、妊娠、藥物和遺傳因素等也與ITP發(fā)病有著密切關(guān)系[2，4]。然而，由于兒童免疫細(xì)胞的發(fā)育和應(yīng)答與成人免疫系統(tǒng)存在一定的差異，目前有關(guān)兒童ITP發(fā)病原因尚未完全明確。IL-10是一種具有免疫抑制功能的細(xì)胞因子，巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞、調(diào)節(jié)性T/B淋巴細(xì)胞（Treg/Breg）等均能表達(dá)抑炎因子。血小板除了具有經(jīng)典的促凝血功能外，也能表達(dá)多種功能受體包括TLR和CD40L[5]。血小板來(lái)源的CD40L能促進(jìn)T細(xì)胞效應(yīng)功能、抑制樹(shù)突狀細(xì)胞分化、促進(jìn)B細(xì)胞分化及抗體類別改變[6-8]。在血小板減少的過(guò)程，機(jī)體會(huì)增加促血小板生成素（thrombopoietin，TPO）的合成。而在ITP體內(nèi)模型中，內(nèi)毒素刺激介導(dǎo)的TLR4信號(hào)能刺激TPO的合成[9]。但TLR9激動(dòng)劑（CpG）聯(lián)合CD40L對(duì)ITP患兒CD3-細(xì)胞的IL-10表達(dá)及存活率的影響尚不清楚。本研究通過(guò)流式細(xì)胞多因子分析技術(shù)（CBA）檢測(cè)ITP患兒血漿IL-10含量，并通過(guò)CpG聯(lián)合CD40L體外刺激ITP患兒和正常對(duì)照PBMC，流式細(xì)胞胞內(nèi)外染色分析CD3-、CD3+、CD3-IL10+細(xì)胞的比例及細(xì)胞存活率等，為闡明兒童ITP的發(fā)病機(jī)制及探索新的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 臨床樣本及資料：選取經(jīng)確診的ITP患兒8例（男5例，女3例），中位年齡4歲，所有患兒均為初發(fā)，診斷符合原發(fā)性ITP[10]，均無(wú)肝炎病毒、巨細(xì)胞病毒、EB病毒感染依據(jù)，自身免疫抗體均陰性。ITP患兒外周血樣本于治療前采集于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院兒童血液科，該過(guò)程經(jīng)過(guò)患兒監(jiān)護(hù)人知情同意并且通過(guò)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)審查。同時(shí)選取7名年齡性別匹配的健康體檢兒童正常外周血作為對(duì)照組。

1.1.2 材料試劑：IMDM細(xì)胞培養(yǎng)液和1 000×β巰基乙醇均購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；青霉素-鏈霉素溶液（100×）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)公司；新生牛血清（FBS）購(gòu)于杭州四季青生物技術(shù)公司；紅細(xì)胞裂解液和人外周血淋巴細(xì)胞分離液均購(gòu)于北京索萊寶生物技術(shù)公司；CpG（OND2006）購(gòu)于美國(guó)Invivogen公司；CD40L購(gòu)于美國(guó)eBioscience公司；流式細(xì)胞胞內(nèi)染色試劑盒及Golgiplug均購(gòu)于美國(guó)BD Bioscience公司；LEGENDplex人炎癥因子檢測(cè)陣列、FITC anti-human CD3及PE anti-human IL-10均購(gòu)于美國(guó)Biolegend公司；LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

1.2 人外周血血漿及PBMC分離 人外周血樣本使用EDTA抗凝管進(jìn)行采集，外周血樣本先利用PBS稀釋混勻，再緩慢加入人外周血細(xì)胞分離液，2 500 r/min 室溫離心20 min，小心吸取管中云霧狀薄層細(xì)胞及血漿層，并分別轉(zhuǎn)移至干凈離心管，含有細(xì)胞的離心管再加入4倍體積PBS洗滌2次后重懸于IMDM完全培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.3 PBMC體外刺激培養(yǎng) 將計(jì)數(shù)后的PBMC按4× 105/孔的細(xì)胞密度置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，并按照實(shí)驗(yàn)條件，設(shè)置僅Golgplug作用組（未刺激組）或加入終濃度為10 μg/mL CpG聯(lián)合1 μg/mL CD40L（含Golgplug）為刺激組。將上述細(xì)胞置于37 ℃二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱，培養(yǎng)5 h。

1.4 流式細(xì)胞染色及分析 刺激后的細(xì)胞重懸于含2% FBS的PBS（FACS緩沖液）中，加入FITC antihuman CD3及LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell染料，冰上染色30 min進(jìn)行細(xì)胞表面抗原的染色。染色后樣本用FACS緩沖液離心洗滌2次后，再按BD胞內(nèi)染色試劑盒說(shuō)明書(shū)配制PE anti-human IL-10，然后進(jìn)行胞內(nèi)抗原的染色。染色后的細(xì)胞將用于流式分析。ITP患兒及正常對(duì)照血漿樣本中IL-10的含量采用LEGEND plex技術(shù)進(jìn)行染色，染色方法按照Biolegend LEGENDplex試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。染色后樣本將用于流式檢測(cè)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 流式多因子染色數(shù)據(jù)采用Biolegend公司LEGENDplexTM軟件進(jìn)行分析處理和作圖。流式細(xì)胞胞內(nèi)外染色數(shù)據(jù)采用Flowjo 9.3.2分析作圖，其他數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism 7.0作圖和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。所有流式數(shù)據(jù)采用BD FACSAria II流式細(xì)胞儀進(jìn)行采集，每個(gè)樣本收集10～15萬(wàn)個(gè)細(xì)胞。2組計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或配對(duì)t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ITP患兒外周血血漿IL-10含量檢測(cè)結(jié)果 流式細(xì)胞多因子檢測(cè)技術(shù)分析了7例正常對(duì)照和8例患兒血漿中IL-10的含量，結(jié)果顯示，相比正常對(duì)照組（5.677±0.808），ITP患兒血漿中IL-10的含量（8.063±0.892）顯著升高，其IL-10含量約為正常對(duì)照組的1.42倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 CpG聯(lián)合CD40L體外刺激前后ITP患兒PBMC中CD3+和CD3-細(xì)胞亞群的變化 采用CpG聯(lián)合CD40L體外刺激7例正常對(duì)照和8例ITP患兒PBMC樣本，結(jié)果顯示，體外刺激5 h后相比未刺激組，正常對(duì)照及ITP患兒CD3-細(xì)胞比例均顯著升高，而CD3+細(xì)胞比例均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖1-2。

圖1 流式檢測(cè)刺激前后PBMC中CD3+及CD3-細(xì)胞比例（%）

圖2 刺激前后PBMC中CD3+及CD3-細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖

2.3 CpG聯(lián)合CD40L體外刺激前后ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞亞群的變化 通過(guò)流式細(xì)胞胞內(nèi)外染色技術(shù)進(jìn)一步分析CD3-細(xì)胞中IL-10表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)ITP患兒刺激前，其PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞比例（0.697±0.056）相比正常對(duì)照組（0.521±0.044）有升高，約為正常對(duì)照組的1.34倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而CpG+CD40L刺激5 h后，正常對(duì)照組及ITP患兒IL-10+CD3-細(xì)胞比例（2.723± 0.358）相比正常對(duì)照組（0.796±0.068）均顯著升高，且相比正常對(duì)照刺激后樣本，體外刺激后的ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞比例升高更為明顯，約為正常對(duì)照組的7.6倍，提示ITP患兒PBMC對(duì)于CpG聯(lián)合CD40L體外刺激誘導(dǎo)CD3-表達(dá)IL-10可能更為敏感，見(jiàn)圖3-4。

圖3 流式檢測(cè)刺激前后PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞比例（%）

圖4 刺激前后PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞比例統(tǒng)計(jì)圖

2.4 CpG聯(lián)合CD40L體外刺激前后ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞存活率變化 進(jìn)一步采用可固定的活細(xì)胞分析染料（Live/Dead Fixable Violet Dye）檢測(cè)CpG聯(lián)合CD40L刺激前后對(duì)PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞存活率的影響。我們發(fā)現(xiàn)，刺激后正常對(duì)照組和ITP患兒PBMC中IL-10+CD3-細(xì)胞存活率均顯著低于未刺激組，ITP患兒IL-10+CD3-細(xì)胞存活率均低于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5-6。

3 討論

ITP是成人和兒童常見(jiàn)的血液疾病，該病最早于1915年由Frank報(bào)道。ITP發(fā)病原因復(fù)雜，誘導(dǎo)因素亦較多。成人患者中多見(jiàn)于諸如自身抗體及CD8+細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的抗血小板免疫反應(yīng)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞活化并吞噬血小板功能，導(dǎo)致成人患者血小板含量下降。大約有70%的ITP患者中存在抗GP IIb/IIIa抗體，有20%～40%的ITP患者中存在抗GP Ib復(fù)合物抗體[11]。另外，有研究也發(fā)現(xiàn)，輔助型T細(xì)胞（Th）如Th1/Th2/Th17/Th22型CD4+T細(xì)胞比例異常[12]、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）數(shù)量的失衡和功能異常[13]、濾泡樣輔助性Tfh異常增殖導(dǎo)致B細(xì)胞分化和抗血小板抗體生成異常等也參與了該病的發(fā)生[14]。然而，對(duì)于非T細(xì)胞（CD3-的免疫細(xì)胞，如髓系細(xì)胞、B細(xì)胞等）如何參與該病發(fā)生，尤其對(duì)于兒童ITP發(fā)病的影響仍未完全明確。

圖5 流式檢測(cè)刺激前后IL-10+CD3-細(xì)胞存活率情況（%）

圖6 刺激前后IL-10+CD3-細(xì)胞存活率統(tǒng)計(jì)圖

以往報(bào)道中發(fā)現(xiàn)ITP成人患者編碼IL-1、IL-2、IL-4、IL-10、IL-17、TNF-α、TGF-β和IFN-γ等細(xì)胞因子的基因存在較多的SNP位點(diǎn)，且這些SNP位點(diǎn)與ITP的發(fā)生存在較大的相關(guān)性[15-19]。雖然，在以往成年ITP患者的研究中發(fā)現(xiàn)成年ITP急性活動(dòng)期患者外周血血清中IL-10水平低于健康對(duì)照及處于臨床穩(wěn)定期的ITP成年患者[20]。然而，本研究通過(guò)LEGEND plex多因子檢測(cè)技術(shù)分析了8例ITP患兒和7例正常對(duì)照的血漿樣本的IL-10含量，發(fā)現(xiàn)ITP患兒樣本中IL-10的含量顯著高于正?；純海摻Y(jié)果與成人患者血清樣本中的IL-10變化趨勢(shì)存在差異，提示ITP患兒中可能存在某些機(jī)制能誘導(dǎo)IL-10的表達(dá)。血小板表面的CD40L已被認(rèn)為是導(dǎo)致T細(xì)胞異?；罨霸黾訕?shù)突狀細(xì)胞等功能的重要因素[21]，成人ITP患者樹(shù)突狀細(xì)胞的TLR9 mRNA的異常表達(dá)可能也與該病的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系[22]。因此，本研究中，我們進(jìn)一步應(yīng)用TLR9激動(dòng)劑（CpG）并聯(lián)合CD40配體，共同體外刺激8例ITP患兒和7例正常對(duì)照PBMC，利用流式細(xì)胞胞內(nèi)外染色技術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，刺激后ITP患兒和正常對(duì)照中CD3-細(xì)胞亞群比例均顯著上調(diào)，提示TLR9和CD40L體外聯(lián)合刺激5 h即能導(dǎo)致影響CD3-細(xì)胞比例的變化。相比正常對(duì)照，ITP患兒在CD3-細(xì)胞中IL-10+細(xì)胞的比例顯著增高，表明ITP患兒CD3-細(xì)胞對(duì)于TLR9和CD40信號(hào)的刺激可能更為敏感，結(jié)果提示ITP患兒PBMC的CD3-細(xì)胞中TLR9及CD40信號(hào)可能存在異常。

綜上，我們發(fā)現(xiàn)ITP患兒PBMC中CD3-細(xì)胞對(duì)TLR9聯(lián)合CD40L刺激介導(dǎo)的IL-10表達(dá)相比正常對(duì)照更為敏感。在將來(lái)的研究工作中，通過(guò)探索ITP患兒中CD3-陰性細(xì)胞中響應(yīng)TLR9和CD40L信號(hào)免疫細(xì)胞類型和作用機(jī)制，以深入闡明ITP的發(fā)病機(jī)制。