向銀洲，李雪軍，鄒玉華，周華軍

（臺州市第一人民醫(yī)院 耳鼻咽喉科，浙江 臺州 318020）

鐵是人體生命活動中不可或缺的重要元素，參與細胞呼吸、DNA合成和細胞周期代謝、細胞排毒等[1]。鐵離子在氧化還原狀態(tài)之間轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生活性氧物質(zhì)，不僅損害脂質(zhì)和蛋白質(zhì)，還導(dǎo)致氧化損傷DNA[2-4]。因此，鐵是細胞生理功能必不可少的物質(zhì)，同時也存在潛在的毒性。鐵能夠通過促進形成自由基而使腫瘤的發(fā)生加速，也可以作為營養(yǎng)元素促進腫瘤細胞生長增殖，提示鐵及鐵代謝途徑可能成為腫瘤治療的新靶點。左旋含羞草堿是一種植物氨基酸，研究發(fā)現(xiàn)其與胸腺嘧啶的結(jié)構(gòu)具有高度相似性，能夠與腺嘌呤在復(fù)制點形成氫鍵，二者具有競爭關(guān)系[5]。左旋含羞草堿對多種腫瘤細胞的生長有抑制作用，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡，并通過螯合鐵離子阻斷癌細胞周期進程，對人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞的生長具有抑制作用，而對正常肝細胞的凋亡幾乎沒有影響[6-7]。本研究通過觀察鐵與左旋含羞草堿對咽鱗狀細胞癌FaDu細胞凋亡的影響，以及DNA損傷相關(guān)蛋白在凋亡過程中的變化，探討左旋含羞草堿促進咽鱗狀細胞癌細胞凋亡的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料 左旋含羞草堿購于美國Sigma公司；人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞株由武漢大學(xué)人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科研究所提供；p-ATM鼠抗人單克隆抗體購于美國Cell Signaling Technology公司；p-ATR鼠抗人單克隆抗體、p-mTOR鼠抗人單克隆抗體購于上海圣克魯斯生物技術(shù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察：人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞配制成密度為105個/mL的單細胞懸液，每孔0.5 mL， 均勻加入到6孔板中，添加適量RPMI 1640培養(yǎng)液，置含5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下的恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜，次日取出放在倒置顯微鏡下觀察細胞貼壁后，每孔分別加入終濃度為0、100、200、 400 μmol/L的左旋含羞草堿培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h、48 h后，取出放在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長狀況。

1.2.2 流式細胞儀檢測FaDu細胞的凋亡：選擇枸櫞酸鐵銨的實驗濃度分別為0、100、500、 1 000 μmol/L，分別加入FaDu細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后收集細胞。加入-20 ℃預(yù)冷70%乙醇固定細胞30 min，放進4 ℃冰箱冷藏過夜。次日取出細胞，傾去乙醇，PBS洗滌細胞3次，加入100 μmol/L 的RNA酶200 μL消化細胞，37 ℃恒溫水浴箱水浴 30 min，滴加20 μmol/L碘化丙啶PI 1 mL，放進4 ℃ 冰箱并遮光染色30 min，上流式細胞儀檢測枸櫞酸鐵銨對FaDu細胞凋亡的影響。另一組實驗將處于對數(shù)生長期的FaDu細胞分為對照組，左旋含羞草堿組，終濃度為200 μmol/L（E組），枸櫞酸鐵銨組，終濃度分別為50 μmol/L（A組），100 μmol/L（B組），左旋含羞草堿+枸櫞酸鐵銨組，終濃度分別為左旋含羞草堿200 μmol/L+枸櫞酸鐵銨50 μmol/L（C組），左旋含羞草堿200 μmol/L+枸櫞酸鐵銨100 μmol/L（D組），培養(yǎng)48 h后收集細胞，-20 ℃預(yù)冷的70%乙醇固定細胞30 min，放進4 ℃冰箱過夜。次日取出細胞，按上述方法檢測枸櫞酸鐵銨、左旋含羞草堿對FaDu細胞凋亡的影響。以上實驗每組設(shè)3個復(fù)孔，以0.9%氯化鈉溶液作為空白對照，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 CCK-8檢測FaDu細胞活性：FaDu細胞制成單細胞懸液，計數(shù)板進行細胞計數(shù)，將細胞配成104個/mL 的細胞懸液，按150 μL、1 500個/孔的標準將細胞接種于96孔板，放置到含5% C02、37 ℃、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，按上述分組，并設(shè)置陰性對照孔，每種濃度均設(shè)3個復(fù)孔。測定每孔pH后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)待用。分別于培養(yǎng)24 h、48 h、72 h、96 h時取出培養(yǎng)板加入CCK-8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，酶標儀測450 nm處OD值，并按照以下公式計算細胞生長抑制率:腫瘤細胞的抑制率（%）=（對照孔OD值-實驗孔OD值）/對照孔OD值×100%[8]。每次實驗重復(fù)3次，并描繪細胞生長曲線。

1.2.4 Western blot法檢測p-ATR、p-histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR等DNA損傷相關(guān)蛋白的表達：將FaDu細胞制成單細胞懸液，進行細胞計數(shù)，以每瓶105個細胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)，放5% CO2、 37 ℃、飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，見細胞貼壁生長，加入左旋含羞草堿，終濃度分別為0、100、200、400 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞，離心5 min，倒去上清液，PBS液洗滌3次，分別轉(zhuǎn)移到1.5 mL Ep管中，100 μL蛋白質(zhì)裂解液Buffer被加入EP管處理細胞，-20 ℃冰箱保存待測。次日10% SDS-PAGE處理細胞樣品，SDS聚丙烯酰胺凝膠中的蛋白質(zhì)被轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，4 ℃冰箱封閉過夜。次日取出硝酸纖維素膜放進含一抗抗體的封閉液中，4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出膜電轉(zhuǎn)液洗滌3次，每次10 min。將膜放入含辣根酶標記的相應(yīng)IgG二抗抗體的封閉液中，室溫下孵育2 h，電轉(zhuǎn)液洗滌3次，每次10 min。最后將膜放在保鮮膜 上，電化學(xué)發(fā)光法檢測p-ATR、p-Histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR蛋白的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料采用表示，多個樣本均數(shù)之間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 細胞形態(tài)學(xué)觀察 倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)了24 h、48 h的人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞的生長狀況，見細胞貼壁生長，連接緊密，密集成片生長，輪廓欠清，透明度大，折光性強，大小均勻。經(jīng)不同濃度的左旋含羞草堿作用后，可見兩種細胞相互離散，細胞皺縮，體積變小，間隙增寬，細胞固縮深染，折光性減弱，細胞數(shù)目明顯減少。隨著左旋含羞草堿濃度的增加和作用時間的延長，培養(yǎng)瓶中懸浮細胞增多，貼壁生長的細胞減少，培養(yǎng)液變渾濁。

2.2 流式細胞儀檢測FaDu細胞的凋亡 枸櫞酸鐵銨（濃度分別為0、100、500、1 000 μmol/L）分別干預(yù)FaDu細胞48 h，流式細胞儀檢測細胞的凋亡率分別為（1.75±0.31）%、（ 1.07±0.28）%、（ 2.12± 0.42）%、（ 2.46±0.49）%，結(jié)果顯示FaDu細胞在100 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，其凋亡率低于對照組；500、1 000 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，F(xiàn)aDu細胞的凋亡率則高于對照組，與100 μmol/L的枸櫞酸鐵銨組比較，細胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。對照組和A-E組的細胞凋亡率分別為（1.78±0.33）%、（ 1.19±0.27）%、（ 1.09±0.25）%、（1.81±0.32）%、（ 1.71±0.30）%、（ 2.95±0.52）%，E組FaDu細胞凋亡最顯著，C組和D組與對照組相比，細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；A組和B組與對照組比，細胞凋亡率減低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.3 CCK-8檢測FaDu細胞的活性 將處于對數(shù)生長期的人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞分組培養(yǎng)后，在24 h、48 h、72 h、96 h取出檢測細胞的活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)E組對FaDu細胞生長的抑制作用最顯著，然后為C組、D組，與對照組比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

2.4 左旋含羞草堿對FaDu細胞p-Histone-H2AX、p-ATR、p-ATM、p-mTOR蛋白表達的影響 FaDu細胞接種于100 mL培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)，分別加入含左旋含羞草堿濃度為0、100、200、400 μmol/L的培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h 后收集細胞，Western blot檢測不同濃度左旋含羞草堿對人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞DNA損傷相關(guān)蛋白表達的影響。結(jié)果顯示，隨著左旋含羞草堿濃度的遞增，p-ATR蛋白的表達降低，p-Histone-H2AX、p-ATM、p-mTOR蛋白的表達增強，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義 （P＜0.05）。見表1。

圖1 不同濃度枸櫞酸鐵銨對FaDu細胞凋亡的影響

圖2 左旋含羞草堿聯(lián)合枸櫞酸鐵銨對FaDu細胞凋亡的影響

圖3 CCK-8檢測左旋含羞草堿聯(lián)合枸櫞酸鐵銨對FaDu細胞活性的影響

3 討論

腫瘤細胞表面存在較多轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，這使轉(zhuǎn)鐵蛋白可能成為化療藥物治療腫瘤的靶點。有實驗將點突變的白喉毒素與腫瘤細胞表面轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合形成復(fù)合物，形成內(nèi)吞囊泡而轉(zhuǎn)移進入腫瘤細胞內(nèi)，從而選擇性地殺死腫瘤細胞；另一方面，白喉毒素與腫瘤細胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，使轉(zhuǎn)鐵蛋白受體喪失了原來的功能，影響了腫瘤細胞鐵代謝，導(dǎo)致腫瘤細胞死亡。以轉(zhuǎn)鐵蛋白或轉(zhuǎn)鐵蛋白受體為靶點的化療藥物在體外細胞實驗和活體實驗中都顯示出對腫瘤細胞較好的細胞毒性[9]。

鐵螯合劑通過螯合細胞內(nèi)鐵影響了癌細胞生物學(xué)行為，抑制了核糖核苷酸還原酶活性，進而影響 DNA的合成和修復(fù)；降低了細胞周期蛋白CyclinA、CyclinB、CyclinD的表達，增加了細胞周期依賴性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs）抑制劑、P27Kip1的表達，降低了CDK2的表達，降低了Rb磷酸化水平和上調(diào)p53基因和代謝抑制基因NDRG1的表達，還影響缺氧誘導(dǎo)因子α（hypoxia inducible transcription factor α，HIF-α）的表達。鐵螯合劑能夠上調(diào)DNA損傷誘導(dǎo)基因（GADD）家族諸多成員mRNA水平和蛋白水平，抑制腫瘤細胞的生長[10]。FaDu細胞在100 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，細胞的凋亡率低于對照組；500、1000 μmol/L枸櫞酸鐵銨作用下，F(xiàn)aDu細胞的凋亡率則高于對照組，與100 μmol/L枸櫞酸鐵銨組比較，細胞凋亡率有顯著性差異，表明一定量的枸櫞酸鐵銨對FaDu細胞的凋亡具有抑制作用，缺鐵或鐵過量對細胞凋亡具有促進作用。左旋含羞草堿能夠促進FaDu細胞的凋亡，加入適量的枸櫞酸鐵銨后，左旋含羞草堿促進FaDu細胞凋亡的作用基本消失。CCK-8法檢測FaDu細胞的活性，結(jié)果顯示左旋含羞草堿單獨作用于FaDu細胞，其抑制細胞生長作用顯著，加入一定量的枸櫞酸鐵銨后，其抑制FaDu細胞生長的作用明顯減弱。這些實驗表明左旋含羞草堿誘導(dǎo)人咽鱗狀細胞癌細胞凋亡的作用是通過干擾癌細胞的鐵代謝來實現(xiàn)的，表現(xiàn)出鐵螯合劑的作用。與KULP等[7]的左旋含羞草堿通過鐵螯合作用阻斷人乳腺癌細胞周期進程，發(fā)揮其抗腫瘤作用的研究結(jié)果基本一致。

表1 左旋含羞草堿對FaDu細胞p-Histone-H2AX、p-ATM、p-ATR、p-mTOR蛋白表達的影響

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛存在于酵母和哺乳動物體內(nèi)，在調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、細胞周期等方面發(fā)揮著重要的作用[11]。在許多腫瘤中，mTOR信號通路的異常改變是最常見的病理變化之一，mTOR信號通路過度激活可導(dǎo)致癌細胞的異常生長、增殖和存活[12]。因此mTOR信號途徑的失調(diào)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著緊密的聯(lián)系。實驗研究發(fā)現(xiàn)，p-mTOR在咽鱗狀細胞癌組織中的表達與左旋含羞草堿作用濃度呈顯著正相關(guān)，推測左旋含羞草堿促進咽鱗狀細胞癌細胞凋亡可能通過AKT/mTOR信號通路來實現(xiàn)。

DNA損傷是指在DNA復(fù)制過程中，外源性和內(nèi)源性的因素引起核苷酸序列發(fā)生了永久性變化，從而導(dǎo)致了遺傳特征的改變，其損傷形式多樣，雙鏈斷裂是DNA損傷的一種類型[13]。抑癌基因ATM（ataxia telangiectasia mutated kinase）在DNA雙鏈損傷時，阻止細胞進入有絲分裂期而發(fā)揮抑癌作用。 p-ATM（phospho-ATM protein）是Ser1981磷酸化的ATM蛋白，主要感應(yīng)和識別內(nèi)源性和外源性誘變因子造成的DNA雙鏈斷裂損傷[14]。DNA雙鏈斷裂能夠促使ATM發(fā)生自動磷酸化，從而激活A(yù)TM激酶[15]，因此p-ATM的表達水平與DNA雙鏈斷裂損傷的狀況相關(guān)。實驗中，隨著左旋含羞草堿作用濃度的增加，p-ATM蛋白表達增強，說明雙鏈斷裂引起的DNA損傷加劇，左旋含羞草堿可能通過對細胞鐵代謝的干擾，導(dǎo)致DAN雙鏈斷裂，引起DNA損傷，促進了FaDu細胞的凋亡。

組蛋白H2AX在細胞的DNA損傷修復(fù)、基因組穩(wěn)定性的維持、細胞周期檢測點調(diào)控和腫瘤生長的抑制中發(fā)揮極其重要的作用，尤其是檢測H2AX的磷酸化過程中形成的γ-H2AX，在評估DNA損傷中具有很大的價值[16]。而DNA雙鏈斷裂位點H2AX的迅速磷酸化，是DNA損傷誘導(dǎo)的早期應(yīng)答。本實驗發(fā)現(xiàn)p-Histone-H2AX的表達與左旋含羞草堿的濃度呈正相關(guān)，進一步提示左旋含羞草堿可能通過調(diào)控細胞鐵代謝誘導(dǎo)人咽鱗狀細胞癌FaDu細胞DNA的雙鏈斷裂損傷，從而導(dǎo)致染色質(zhì)斷裂、細胞突變，最終引起細胞凋亡。

左旋含羞草堿可能通過干擾人咽鱗狀細胞癌細胞的鐵代謝，調(diào)控AKT/mTOR等信號通路，引起細胞DNA的雙鏈斷裂損傷，發(fā)生細胞突變，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡。