董嬌嬌，夏芳芳，金周晟，張裕堅，劉樂

（溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

體外循環(huán)心臟直視手術及經皮冠狀動脈介入治療不可避免地造成了心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）損傷[1]。Intralipid是以大豆油為基礎的長鏈脂肪乳劑，是世界上第一個安全應用于人體的脂肪乳劑。Intralipid后處理對心肌I/R損傷的保護機制主要涉及再灌注損傷補救激酶通路、脂肪酸氧化增強心肌收縮力等[2-3]。本研究通過構建在體大鼠心肌I/R模型，監(jiān)測大鼠血流動力學、心肌梗死面積和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）釋放量，探討Intralipid缺血前短期預處理的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物與分組：成年雄性SD大鼠，體質量180～200 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，動物許可證號：SCXK（滬）2012-0002。實驗前禁食12 h，自由飲水。采用隨機數(shù)字表法分為3組（每組7只）：假手術組（Sham組）、模型組（Model組）、長鏈脂肪乳劑組（LE組）。Sham組不予以任何藥物處理，建模時只穿線不結扎冠狀動脈左前降支（left anterior descending，LAD）；Model組于造模前予以0.9%氯化鈉溶液2 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射5 d；LE組于造模前予以Intralipid 2 mg·kg-1·d-1尾靜脈注射5 d，2組末次給藥后24 h建立大鼠左前降支結扎I/R模型。

1.1.2 試劑與儀器：Intralipid（批號：801H081，無錫華瑞制藥有限公司），LDH測試盒（A020-2型，南京建成生物工程研究所），穿刺針（14 G， Introcan-W，馬來西亞B.Braun公司），動物呼吸機（HX-300型，成都泰盟科技有限公司），生物信號采集系統(tǒng)（Medlab-U/4C051，南京美易科技有限公司），Mer-silk慕絲縫線（上海強生醫(yī)療器材有限公司），光吸收全波長酶標儀（瑞士Tecan Infinite公司）。

1.2 方法

1.2.1 建立大鼠心肌I/R損傷模型：末次給藥后24 h， 將SD大鼠行水合氯醛（350 mg/kg）腹腔基礎麻醉加七氟烷（1%～2%）吸入維持麻醉。待動物麻醉后，切開氣管置入14 G穿刺針外套管，連接小動物呼吸機。呼吸參數(shù)設定：潮氣量=6 mL·kg-1，呼吸頻率=68次/min， 呼吸比3:2，F(xiàn)iO2100%。控制體溫在38～39 ℃。開放左股靜脈補充生理需要量（5 mL·kg-1·h-1），左股動脈切開置管，連接生物信號采集系統(tǒng)，測定平均動脈壓（mean arterial pressure，MAP）、心率（HR）、心率與收縮壓的乘積（rate-pressure product，RPP）。操作結束后平衡15 min，將大鼠左側胸壁逐層離斷，結扎并移除第3、4肋骨，調整呼吸機參數(shù)：

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料用表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t法。不同時間點間比較用重復測量方差分析，兩兩比較用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠基礎狀態(tài)比較 3組大鼠的體質量及血流動力學基礎值比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 3組大鼠梗死面積及LDH比較 再灌注120 min末Model組和LE組AAR/LV均顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Model組與LE組AAR/LV比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；Model組和LE組的IR/AAR和IR/LV均顯著高于Sham組，差異有統(tǒng)潮氣量=7.5 mL·kg-1，呼吸頻率=68次/min，呼吸比3:2，F(xiàn)iO2100%。打開心包直視下將6-0 Mersilk慕絲縫線結扎LAD。結扎成功標志：心電圖ST段抬高、R波增寬加深及LAD供血區(qū)心肌顏色變?yōu)樽习咨?。結扎成功后，用橡膠薄膜貼附在胸壁開口處，消除開放性氣胸。結扎缺血30 min后，松開結扎線再灌注120 min。

1.2.2 觀察血流動力學指標：記錄3組平衡末（基礎值），缺血期0、5、10、15、20、25、30 min，再灌注期0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120 min時的HR、MAP、RPP。

1.2.3 伊文思藍（EB）-2，3，5一氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法確定心肌梗死面積：再灌注期末，結扎絲線，經左股動脈取血后，注射2.5 mL 2% EB染料。待結扎區(qū)外心肌染為藍色后，沿心底部剪下心臟，沖洗后放入-20 ℃冰箱冷凍25～30 min。取出后將結扎線以下部位切2 mm薄片，共5片。放入含有1%的TTC凍存管中超聲波振動10 min，取出沖洗并放入4%甲醛中固定6～8 h后拍照保存，梗死面積用Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件分析并計算危險區(qū)心肌占左室面積百分比（AAR/LV）、梗死面積占危險區(qū)心肌百分比（IR/AAR）、梗死面積占左室面積百分比（IR/LV）。

1.2.4 檢測血清LDH：再灌注期末經股動脈取血 3 mL，3 500×g，4 ℃離心15 min，取上清液于 -80 ℃冰箱保存，采用光吸收全波長酶標儀測定血清LDH含量。計學意義（P＜0.05）；與Model組比，LE組IR/AAR和IR/LV顯著減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；Model組和LE組血漿LDH濃度均顯著高于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與Model組比較，LE組血漿LDH濃度明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

表1 3組大鼠的體質量和血流動力學基礎值（每組n=7， ）

表1 3組大鼠的體質量和血流動力學基礎值（每組n=7， ）

組別 體質量（g） HR（beat·min-1） MAP（mmHg） RPP（mmHg·beat·min-1）Sham組 278±16 380±30 90± 9 44 537±4 441 Model組 276±14 413±36 84±16 43 339±9 966 LE組 268±17 404±49 78±13 41 903±3 469F0.777 1.360 1.500 0.279P0.475 0.282 0.250 0.760

2.3 3組大鼠缺血期及再灌注期不同時間點HR比較 Model組和LE組大鼠缺血期及再灌注期HR均呈先升高后降低，3組間缺血期及再灌注期HR比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

表2 3組再灌注120 min末AAR/LV、IR/AAR、IR/LV及血漿LDH的比較（每組n=7， ）

表2 3組再灌注120 min末AAR/LV、IR/AAR、IR/LV及血漿LDH的比較（每組n=7， ）

與Sham組比：aP＜0.05；與Model組比：bP＜0.05

組別 AAR/LV（%） IR/AAR（%） IR/LV（%） LDH（U/gprot）Sham組 1.00 0 0 2 463.58±234.23 Model組 0.52±0.09a0.67±0.14a0.36±0.09a5 431.00±215.97aLE組 0.54±0.06a0.49±0.10ab0.26±0.06ab4 728.00±191.29abF174.557 48.562 59.626 365.806P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 3組缺血期（A）及再灌注期（B）不同時間點HR圖

2.4 3組大鼠缺血期及再灌注期不同時間點MAP比較 Model組在缺血期（5、10、15、20、25、 30 min）MAP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義 （P＜0.05），見圖2A；Model組在再灌注期（除80、95、100、115 min外）MAP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖2B；與Sham組比，LE組缺血期及再灌注期MAP差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖2。

2.5 3組大鼠缺血期及再灌注期不同時間點RPP比較 Model組在缺血期（10、15、20、25、30 min）RPP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），見圖3A；Model組在再灌期（10、20、30、35、40、45、50、55、60、65、105、120 min）RPP顯著低于Sham組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖3B；與Sham組比，LE組缺血期及再灌注期RPP差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖3。

3 討論

圖3 3組缺血期（A）及再灌注期（B）不同時間點RPP圖

大鼠LAD結扎30 min再灌注120 min模型目前被廣泛應用于心肌I/R的相關研究[4]，EB-TTC染色后計算得到的心肌梗死面積相關指標是判斷心肌I/R損傷最常見的指標[5]。本課題組在之前的研究中采用Intralipid和布比卡因共同孵育心肌細胞24 h，發(fā)現(xiàn)Intralipid能夠逆轉布比卡因引起的心肌細胞膜流動性的降低[6]。20%的Intralipid中含有200 g·L-1甘油三酯，其中52%為ω-6亞油酸，8%為ω-3亞麻酸。有研究證實ω-6和ω-3多不飽和脂肪酸通過改變細胞膜的完整性和流動性從而激活重要的生物介質，進而調節(jié)細胞凋亡、炎癥介質、免疫應答等途徑的細胞信號傳導[7]。細胞膜相結構的穩(wěn)定對于再灌注損傷的保護起到重要作用。因此，認為Intralipid預處理通過改變膜磷脂成分維持細胞膜相結構穩(wěn)定性，從而減小心肌I/R損傷后梗死面積，減少LDH的釋放。

PAULSON等[8]通過灌注L-propionylcarnitine促進離體大鼠心肌細胞的脂肪酸氧化過程，提高心肌ATP濃度，結果顯著促進了大鼠心肌I/R損傷后心肌收縮力的恢復。同時，有研究認為脂肪乳劑逆轉布比卡因心臟毒性在于其正性肌力作用[9]。本研究中大鼠LAD結扎致使大鼠左心室結扎部位以下的心肌收縮力減弱，導致MAP急劇下降。然而LE組大鼠缺血期MAP下降不明顯，在不考慮外周循環(huán)阻力和循環(huán)血流量發(fā)生變化的情況下，可以將LE組MAP的穩(wěn)定歸因于心肌收縮力變化小，從而表明LE組心肌對缺血缺氧的耐受力高于Model組，最終使得LE組缺血期RPP能夠恢復至Sham組水平。缺血使得細胞內ATP減少，離子通道功能障礙，最終導致細胞鈣超載并裂解死亡。LE組在缺血前Intralipid預處理 5 d，長鏈脂肪酸在體內經過氧化生成ATP，心肌ATP儲備高于Model組，對缺血期ATP的耗竭起到重要的緩沖作用，從而減輕心肌損傷。另外，有研究認為低濃度的脂肪酸能夠氧化生成ATP提供能量，而高濃度的脂肪酸則會加重細胞內鈣超載從而引起細胞死亡[10]，MONTI等[11]采用10、20、40 mg·mL-1甘油三酯進行離體大鼠心臟灌注，結果發(fā)現(xiàn)再灌注期心臟收縮和舒張功能隨著甘油三酯灌注濃度的增加而變差，而本研究采用20% Intralipid 2 mg·kg-1·d-1預處理，考慮大鼠血液量占體質量約7%，計算得到Intralipid給藥后大鼠體內甘油三酯最高血液濃度不超過5.71 mg·mL-1，顯著低于MONTI等[11]采用的劑量。

缺血再灌注損傷和自由基攻擊緊密相關，有研究表明長鏈脂肪乳劑的包裹機制有利于減少再灌注產生的脂溶性有害物質從而減輕遠隔臟器的再灌注損傷[7]。再灌注期自由基大量產生，造成機體內環(huán)境紊亂，無氧代謝增加，血管麻痹，從而導致循環(huán)障礙。本研究結果示Model組再灌注初期0至 40 min MAP及RPP呈持續(xù)降低狀態(tài)，而LE組再灌注期MAP和RPP水平均跟Sham組相仿，這和長鏈脂肪乳劑包裹再灌注期脂溶性有害物質密切相關。

本研究結果表明20% Intralipid 2 mg·kg-1·d-1預處理5 d能夠顯著減小大鼠心肌I/R損傷后心肌梗死面積，減少LDH釋放，同時促進血流動力學恢復，并推論其保護機制可能包括以下三點：改變膜磷脂成分維持細胞膜穩(wěn)定性、脂肪酸氧化提供能量以及脂肪乳劑包裹脂溶性有害物質。