陳瑞瑤，榮星，吳婷婷，賈嘗，吳蓉洲，褚茂平，張春祥

（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.兒童心臟中心；2.兒科研究所）

川崎?。↘awasaki disease，KD）是一種以全身性血管炎為主要病變的急性自限性疾病，病因不明，冠狀動(dòng)脈瘤是最嚴(yán)重的并發(fā)癥[1-2]。既往研究表明內(nèi)皮細(xì)胞損傷是KD發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制，但具體機(jī)制仍然不清楚[3-5]。長鏈非編碼RNAs（lncRNAs）是一類長度大于200 nt的RNA，具有強(qiáng)大的生物學(xué)功能[6-9]。目前尚未見關(guān)于KD血漿對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs表達(dá)的影響和lncRNAs在KD誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷中的潛在作用的報(bào)道。Linc01635（ENST00000455966.1，chr1：22023994-22024968）是基因間lncRNA，長度為615 bp。Linc01635在內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能目前尚不清楚。我們的初步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，KD患者血漿培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）中l(wèi)inc01635表達(dá)明顯降低。HUVECs中的linc01635在KD血漿培養(yǎng)下表達(dá)量降低可能與細(xì)胞損傷有關(guān)，本研究探討linc01635在KD誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 HUVECs購自江陰齊氏生物科技有限公司；TRIzol試劑和Lipofectamine 3000購于美國Invitrogen公司；胎牛血清和高糖DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；引物、siRNA和FISH試劑盒購于廣州銳博公司；Annexin V PE流式試劑盒購于美國Becton Dickinson公司；PrimeScriptTMRT Master Mix購于日本TaKaRa公司；SYBR Green和96孔板購于美國BIORAD公司；慢病毒購于上海漢恒生物科技公司；4%多聚甲醛、無水乙醇和異丙醇購于上海化學(xué)試劑總廠。

1.2 方法

1.2.1 血漿標(biāo)本采集：根據(jù)美國兒童心臟協(xié)會(huì)制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)確診KD急性期的患者[1]，收集2018年11月至2019年1月溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院10例急性期KD患者的血漿，以及年齡和性別相匹配的10例健康兒童血漿。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有入組者家屬知情同意并簽署同意書。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)和血漿刺激：有研究報(bào)道，HUVECs 可用于KD的血管內(nèi)皮研究[4，10]，所以本研究將 HUVECs作為體外模型。用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃，5% CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。用含10% KD患者血漿或10%健康兒童血漿的DMEM培養(yǎng)液刺激HUVECs，分別為KD組和HC組，24 h后棄去培養(yǎng)液收集細(xì)胞。

1.2.3 qRT-PCR：按照TRIzol試劑說明書提取細(xì)胞總RNA。使用PrimeScriptTMRT Master Mix將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用CFX96TM Real-Time系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR分析。GAPDH作為內(nèi)參，通過比較循環(huán)數(shù)，計(jì)算mRNA和lncRNA的相對(duì)表達(dá)情況。引物序列（5’-3’）：GAPDH：FAACTCTGGTAAAGTGGATATTG（F），RGGTGGAATCATATTGGAACA（R）；linc01635：GCTGGCA TATCCGAATGG（F），GCAGTGGCAATGTTGACA（R）。

1.2.4 熒光原位雜交（FISH）：RNA FISH使用結(jié)合Cy3的linc01635探針、人U6 FISH探針和人18S FISH探針，根據(jù)RiboTM熒光原位雜交試劑盒進(jìn)行操作。采用共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）獲取圖像。

1.2.5 Linc01635敲減或過表達(dá)：使用Lipofectamine 3000試劑將100 nmol/L linc01635 siRNA（5’-GGGCTG AGCTACCGGATTA-3’）或陰性對(duì)照siRNA轉(zhuǎn)染到HUVECs。轉(zhuǎn)染24 h后，采用qRT-PCR檢測(cè)敲減效率。用帶有l(wèi)inc01635全長序列的慢病毒感染HUVECs（MOI 30）， 48 h后，在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞感染效率，采用qRT-PCR檢測(cè)過表達(dá)效率。

1.2.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè)：HUVECs經(jīng)慢病毒過表達(dá)linc01635（LV-linc01635）、慢病毒過表達(dá)陰性對(duì)照（LV-NC）、siRNA敲減linc01635（si-linc01635）或siRNA敲減陰性對(duì)照（si-NC）處理后，用100 μmol/L TBHP誘導(dǎo)凋亡，24 h后消化收集細(xì)胞，用Annexin V PE和7-AAD避光孵育，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料以表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Linc01635在HUVECs中的亞細(xì)胞定位 利用生物信息學(xué)網(wǎng)站（www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ lncLocator）分析，預(yù)測(cè)linc01635主要分布于細(xì)胞核（61.4%）和細(xì)胞質(zhì)（33.0%）[11]。采用RNA FISH技術(shù)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)linc01635在HUVECs中具有核質(zhì)雙重分布，見圖1。

2.2 Linc01635在KD細(xì)胞模型中表達(dá)下降 與HC組比，KD組血漿培養(yǎng)的HUVECs中l(wèi)inc01635相對(duì)表達(dá)量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

2.3 Linc01635對(duì)HUVECs凋亡的影響 LV-linc01635組linc01635表達(dá)量比LV-NC組高，silinc01635組linc01635表達(dá)量比si-NC組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。流式細(xì)胞術(shù)分析顯示，在TBHP誘導(dǎo)凋亡下，linc01635過表達(dá)抑制了HUVECs的凋亡，而linc01635敲減使HUVECs凋亡增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖4。

圖1 Linc01635的RNA熒光原位雜交

圖2 2組血漿培養(yǎng)的HUVECs中l(wèi)inc01635的相對(duì)表達(dá)量比較

2.4 過表達(dá)linc01635抑制KD血漿誘導(dǎo)的HUVECs凋亡 本研究表明，KD血漿可以降低HUVECs中l(wèi)inc01635的表達(dá)，而linc01635能影響細(xì)胞凋亡。因此，我們推測(cè)linc01635的減少可能是KD誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的一種新分子機(jī)制。為了驗(yàn)證這種推測(cè)，我們分別用10%的KD血漿和10%的健康對(duì)照血漿培養(yǎng)HUVECs。結(jié)果表明，KD血漿能促進(jìn)HUVECs凋亡，而過表達(dá)linc01635能抑制KD血漿誘導(dǎo)的凋亡，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖5。

3 討論

KD已成為兒童獲得性心臟病最常見的病因之一，而冠狀動(dòng)脈瘤等KD誘導(dǎo)的血管損傷已成為成人缺血性心臟病的重要危險(xiǎn)因素[12]。血管內(nèi)皮損傷是KD冠狀動(dòng)脈瘤的早期病理過程之一，但是KD血管損傷的病理機(jī)制尚不清楚[13-14]。

LncRNAs是一類非編碼RNAs，在生理和病理過程中具有重要的生物學(xué)功能，包括心血管疾病[15-17]。 有研究表明，血液中的miRNAs在KD血管損傷中發(fā)揮重要的作用[4，18]。之前的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與健康兒童相比，KD患者血液中的lncRNA異常表達(dá)[19-20]。因此，血液中的lncRNA可能與KD有關(guān)。然而，KD血漿對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)ncRNAs表達(dá)的影響及l(fā)ncRNAs在KD誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用尚不清楚。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)KD血漿培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞中，linc01635表達(dá)量明顯降低。目前尚不清楚血管內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)inc01635表達(dá)量的降低是由linc01635轉(zhuǎn)錄水平降低引起的，還是向細(xì)胞外釋放linc01635增多引起的，也可能是兩者共同作用的結(jié)果，這需要后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)行研究。關(guān)于linc01635在血管內(nèi)皮細(xì)胞中的生物學(xué)功能，目前還未見報(bào)道。在本研究中，通過過表達(dá)和敲減linc01635，發(fā)現(xiàn)linc01635對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞具有調(diào)控凋亡的作用。為了驗(yàn)證linc01635在KD誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡中的作用，我們分析了KD患者的血漿。研究發(fā)現(xiàn)，KD血漿可以誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，而過表達(dá)linc01635可以抑制KD血漿誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。

圖3 HUVECs中慢病毒感染和siRNA敲減后linc01635的相對(duì)表達(dá)量

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)linc01635對(duì)HUVECs凋亡的影響

圖5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)linc01635對(duì)KD誘導(dǎo)的HUVECs凋亡的作用

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)KD血漿處理會(huì)導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞中l(wèi)inc01635表達(dá)量下降，而linc01635表達(dá)量的減少會(huì)促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。Linc01635可能是治療KD血管損傷的新靶點(diǎn)。