汪佳男，朱忠欣，叢維濤

（溫州醫(yī)科大學 藥學院，浙江 溫州 325035）

皮膚對機體發(fā)揮著重要的屏障作用，一方面皮膚可以使機體內(nèi)的組織器官免受諸如物理性、機械性損傷或病原微生物等侵害，另一方面調(diào)節(jié)機體內(nèi)水、電解質(zhì)等物質(zhì)的動態(tài)平衡，保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。作為人體第一道防線，皮膚易受損傷（如燒傷、慢性疾病等），從而失去屏障效應，誘發(fā)感染，嚴重時可致殘致死[1-3]。因此，加快皮膚的創(chuàng)面修復，無論是在傷口難愈的疾病還是在術(shù)后修復中均具有十分重要的臨床意義[4]。

RSK2，即p90核糖體蛋白s6激酶，在多種細胞中均有表達。RSK2能夠應答多種生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)和環(huán)境壓力等[5]。RSK2調(diào)控的下游底物包括：ATF1、ATF4（CREB2）等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控細胞轉(zhuǎn)錄[6]；Caspase-8、IκB等信號分子抑制細胞凋亡、調(diào)節(jié)細胞活性[7]；組蛋白3、組蛋白2AX等表觀遺傳因子調(diào)控細胞的增殖與分化[8-9]。RSK2目前在腫瘤領域中研究比較廣泛，腫瘤誘導藥物如佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（TPA）可激活RSK2，進而誘發(fā)腫瘤病變[10]。LUDWIK等[11]發(fā)現(xiàn)，RSK2的核內(nèi)聚集能夠促進乳腺癌的腫瘤生成。盡管RSK2能夠調(diào)控細胞的增殖與遷移，但其在皮膚創(chuàng)面修復中的研究卻未見報道?；谏鲜鲅芯勘尘?，本研究探討RSK2對小鼠皮膚創(chuàng)面修復的影響。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級C57BL/6雄性小鼠購于浙江維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（浙）2019-0001。小鼠體質(zhì)量約25 g，約8周齡，標準動物飼料喂養(yǎng)，清潔飲水，自由取食。

1.1.2 主要試劑與耗材：一抗RSK2、Vimentin、Fibronectin、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）購于美國CST公司；Cyclin D1、血小板-內(nèi)皮細胞黏附分子 （plateletendothelial cell adhesion molecule，CD31）購于美國Abcam公司；GAPDH購于合肥Biosharp公司。組織裂解液、BCA試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒購于日本同仁化學研究所；ECL曝光液購于美國Millipore公司。

1.1.3 主要儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）、-80 ℃超低溫冰箱（德國Eppendorf公司）、低溫高速離心機（美國Thermo公司）、高通量組織研磨儀（上海萬柏公司）、細胞超聲破碎儀（寧波新芝公司）、微量移液器（德國Eppendorf公司）、化學發(fā)光成像儀（美國GE公司）、激光共聚焦顯微鏡（德國Leica公司）、正置顯微鏡（日本Nikon公司）、倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 方法

1.2.1 人原代真皮成纖維細胞（human dermal fibroblast，HDF）的提取：選取溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院健康男性兒童的包皮組織，從中提取原代真皮成纖維細胞[12-13]。本研究征得患者及其家屬的知情同意并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2.2 細胞遷移實驗：將HDF接種于48孔板，培養(yǎng)24 h。用槍頭劃直線，創(chuàng)傷+Bix 02565組加入Bix 02565共同孵育2 h，創(chuàng)傷對照組給予等體積0.9%氯化鈉溶液，分別于0、12、24 h后用倒置顯微鏡拍攝各組細胞的遷移狀況，以12 h或24 h劃痕后面積變化作為細胞遷移速率。

1.2.3 CCK-8法檢測細胞增殖活性：將HDF接種至96孔培養(yǎng)板內(nèi)，密度控制在每孔2×103個細胞。待細胞貼壁，用槍頭對創(chuàng)傷組別劃痕，加入Bix 02565，培養(yǎng)2 h。每孔加入CCK-8試劑10 μL，培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2～3 h，酶標儀下測定450 nm波長處吸光度。每組均設空白對照組，各組測得的吸光度減去空白組的吸光度作為最終吸光度值。

1.2.4 Western blot實驗：向經(jīng)劃痕造模的HDF中加入RSK2抑制劑Bix 02565（5 μmol/L）孵育2 h。HDF經(jīng)裂解超聲破碎后，于4 ℃、15 000 r/min離心15 min，取上清液檢測蛋白濃度。將等量裂解蛋白經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，利用轉(zhuǎn)膜儀將凝膠內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。置于5%脫脂奶粉中室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，用化學發(fā)光成像儀曝光。

1.2.5 實驗動物模型的建立和分組：將24只雄性小鼠隨機分為創(chuàng)傷對照組和創(chuàng)傷+Bix 02565組（Bix 02565：1 mg/kg）。小鼠用5%水合氯醛0.8 mL/100 g 劑量腹腔注射麻醉，脫去背部毛發(fā)后消毒，兩側(cè)使用內(nèi)徑為8 mm硅膠環(huán)固定，沿內(nèi)徑剪去全層皮膚。創(chuàng)傷+Bix 02565組在創(chuàng)傷造?；A上皮下注射RSK2抑制劑Bix 02565（1 mg/kg），每2天注射1次。創(chuàng)傷對照組于同一時間皮下注射等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2.6 創(chuàng)面修復速率檢測：術(shù)后第0、第3、第7、第14天，每天同一時間記錄創(chuàng)面修復狀況，計算創(chuàng)面修復率。

1.2.7 皮膚組織HE染色：取下小鼠創(chuàng)面全層皮膚組織，經(jīng)固定、石蠟包埋、脫蠟與水化后，切片（5 μm） 置于蘇木精溶液1 min，流水沖洗1 min；置于伊紅染液30 s，流水沖洗1 min；脫水、二透明、封片，正置顯微鏡拍攝。

1.2.8 皮膚組織Masson染色：皮膚切片用Bouin液37 ℃固定2 h，流水沖洗至無黃色；天青石藍30 s， 稍水洗；蘇木素染色2～5 min，稍水洗；酸性乙醇分化液數(shù)秒，流水沖洗3 min；麗春紅品紅染色液染色5～10 min，稍水洗；磷鉬酸溶液洗10～15 min。 傾去液體，直接入苯胺藍3～5 min。0.2%弱醋酸工作液2 min。脫水、透明、封片。

1.2.9 免疫熒光染色：皮膚切片置于含0.3% Triton X-100的PBS中室溫通透20 min，PBS洗滌3次，每次5 min。含5% BSA的PBS封閉60 min。1% BSA的PBS配置一抗，室溫孵育4 h。PBS漂洗3次，每次5 min。 1% BSA的PBS配置二抗，室溫避光孵育1 h。PBS漂洗3次，每次5 min。DAPI染細胞核10 min，PBS漂洗2次，每次5 min。滴加抗熒光淬滅劑，封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計學處理方法 采用Graphpad Prism 5軟件進行統(tǒng)計學分析，每組實驗至少平行重復4次，計量資料以表示，2組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 皮膚創(chuàng)傷對RSK2蛋白表達無影響 小鼠創(chuàng)傷造模后的第0（D0）、第3（D3）、第7（D7）天，利用Western blot實驗檢測創(chuàng)面及周圍全層皮膚組織RSK2的蛋白表達。結(jié)果顯示，創(chuàng)傷后第3和第7天創(chuàng)面皮膚組織中RSK2的蛋白表達與第0天相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1A-B。免疫熒光染色并統(tǒng)計分析RSK2的熒光強度，與Western blot結(jié)果一致，創(chuàng)傷后第3和第7天創(chuàng)面皮膚組織中RSK2的熒光強度與第0天相比差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1C-D。

圖1 創(chuàng)面皮膚組織中RSK2的蛋白表達與免疫熒光強度變化

2.2 Bix 02565抑制劃痕誘導的HDF增殖與遷移 RSK2的抑制劑Bix 02565用于細胞劃痕遷移實驗，創(chuàng)傷+Bix 02565組的HDF在劃痕后12 h及24 h，其中央創(chuàng)傷面積占比顯著大于創(chuàng)傷對照組（P＜0.05）， 即Bix 02565抑制了HDF的遷移，見圖2A。同時，CCK-8法檢測HDF的增殖活性實驗中，HDF經(jīng)劃痕刺激后的增殖活性顯著強于創(chuàng)傷對照組，在Bix 02565 給藥后增殖水平顯著回落（P＜0.01），而抑制劑本身并不影響細胞活性，見圖2B。

將HDF總蛋白樣品用于Western blot實驗，結(jié)果表明，HDF在劃痕刺激后Cyclin D1（G1/S-特異性周期蛋白-D1，指征增殖水平）及Fibronectin（纖維粘連蛋白，指征遷移水平）的蛋白水平均出現(xiàn)上調(diào)，而加入RSK2抑制劑Bix 02565可顯著抑制細胞劃痕誘導的Cyclin D1和Fibronectin的表達上調(diào)（P＜0.05），圖2C-D。

2.3 Bix 02565減緩小鼠皮膚創(chuàng)面修復速率 在小鼠皮膚創(chuàng)傷第0、第3、第7、第14天后，分別拍攝皮膚創(chuàng)面修復狀況，2組均有不同程度的愈合，而給予Bix 02565后第3、第7天創(chuàng)傷面積所占百分比均顯著大于創(chuàng)傷對照組（P＜0.05），見圖3。同時，將第3、第7天創(chuàng)面處全層皮膚組織進行HE染色和Masson染色。HE染色結(jié)果顯示，創(chuàng)傷+Bix 02565組傷口大小在第3、第7天均大于創(chuàng)傷對照組，見圖4A。Masson染色結(jié)果證實，創(chuàng)傷+Bix 02565組創(chuàng)面下方肉芽組織的膠原纖維（藍色）含量遠低于創(chuàng)傷對照組，而膠原纖維是由肌成纖維細胞分泌，提示成纖維細胞的增殖及分化不足，見圖4B。

圖2 Bix 02565抑制細胞劃痕誘導的HDF增殖與遷移

圖3 Bix 02565減緩小鼠皮膚創(chuàng)面修復速率

2.4 Bix 02565抑制小鼠皮膚成纖維細胞的增殖與血管新生 小鼠創(chuàng)傷造模的第3、第7天對皮膚組織進行免疫熒光染色，分別檢測創(chuàng)面新生肉芽組織中PCNA與CD31。結(jié)果顯示2組PCNA熒光強度均隨創(chuàng)傷天數(shù)增加逐漸增強，而創(chuàng)傷+Bix 02565組熒光強度顯著弱于創(chuàng)傷對照組，且第7天差距最為顯著（P＜0.05），見圖5A-B。檢測創(chuàng)傷后第7天創(chuàng)面肉芽組織內(nèi)的新生血管數(shù)量，結(jié)果顯示創(chuàng)傷+Bix 02565組的新生血管內(nèi)徑顯著小于創(chuàng)傷對照組，且新生血管數(shù)量也少于創(chuàng)傷對照組，見圖5C。

3 討論

皮膚是機體最大的器官，在機體中扮演重要的角色。而皮膚是最容易受到外界損傷的器官，創(chuàng)面修復是一個精確復雜、分時相的動態(tài)過程，涉及細胞增殖、遷移、胞外基質(zhì)降解、血管新生和上皮組織重塑等多種細胞的網(wǎng)絡調(diào)控[14-15]。各時期的過渡轉(zhuǎn)化主要取決于所參與細胞的類型及新生細胞的成熟與分化，涉及的細胞包括成纖維細胞、角質(zhì)細胞、內(nèi)皮細胞和巨噬細胞等[16]。這些細胞通過增 殖、遷移、分化，與生長因子等信號通路共同作用重建皮膚[3]。其中，細胞增殖與遷移能夠激發(fā)新的細胞外基質(zhì)生成并且促進創(chuàng)面修復[17]。在這一過程中，尤其是成纖維細胞的增殖與遷移對肉芽組織形成和促進創(chuàng)面修復尤為關(guān)鍵[18]，REINKE等[19]研究表明，成纖維細胞主要參與增殖期與組織重塑期。在增殖期，成纖維細胞大量增殖、遷移并形成肉芽組織，主要起到抵抗感染、添補創(chuàng)面等作用。同時，傷口周邊的角質(zhì)細胞經(jīng)誘導遷移至創(chuàng)傷處，形成新生表皮組織。到組織重塑階段，由成纖維細胞分化而來的肌成纖維細胞、內(nèi)皮細胞及巨噬細 胞發(fā)生凋亡，最終真皮組織由細胞外基質(zhì)蛋白所填補[20]。在保證機體自身修復質(zhì)量的同時，使皮膚盡快恢復屏障功能一直是皮膚領域研究的熱點所在。在之前的大量研究中，諸多激酶如Akt、STAT3、GSK-3α/β等都發(fā)揮著不可或缺的作用[21-23]。

圖4 小鼠創(chuàng)傷造模后第3、第7天創(chuàng)面皮膚切片組織HE染色和Masson染色結(jié)果

圖5 Bix 02565抑制小鼠皮膚成纖維細胞的增殖與血管新生

RSK2作為20世紀末期發(fā)現(xiàn)的蛋白激酶[24]，人們對于其功能的了解往往限于疾病的發(fā)生與發(fā)展中，而忽視其在維持機體平衡中的作用。本研究著重將RSK2與成纖維細胞和創(chuàng)面修復聯(lián)系在一起。在研究過程中，我們發(fā)現(xiàn)皮膚創(chuàng)傷與RSK2的總蛋白表達并無直接聯(lián)系。然而，進一步實驗發(fā)現(xiàn)RSK2活性抑制劑Bix 02565可抑制成纖維細胞的遷移。為了進一步核實RSK2在皮膚創(chuàng)面修復中的作用，我們通過CCK-8試劑盒檢測發(fā)現(xiàn)Bix 02565顯著抑制了成纖維細胞的增殖水平，而其對正常細胞本身并無毒性作用。在Western blot實驗中確證了增殖及遷移相關(guān)蛋白的表達亦被Bix 02565抑制。體內(nèi)實驗，我們建立C57BL/6小鼠皮膚創(chuàng)傷模型，探究RSK2在皮膚創(chuàng)面修復中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Bix 02565顯著減緩了皮膚的創(chuàng)面修復速率，抑制創(chuàng)面處肉芽組織膠原纖維的生成。同時，通過免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)Bix 02565抑制了增殖相關(guān)蛋白的表達以及血管新生?；谏鲜鰧嶒灲Y(jié)果，我們可以推斷，盡管創(chuàng)傷并不影響RSK2本身的表達，但可能存在以下幾種可能性：①創(chuàng)傷條件下成纖維細胞中RSK2的氨基酸位點發(fā)生修飾，在碳、氮末端激酶結(jié)構(gòu)域（CTKD、NTKD）與中央鉸鏈區(qū)（LD）均有可能出現(xiàn)絲氨酸、蘇氨酸的磷酸化修飾，從而調(diào)節(jié)下游信號級聯(lián)。②創(chuàng)傷影響了RSK2與下游蛋白的結(jié)合能力從而調(diào)節(jié)下游信號。③創(chuàng)傷改變了RSK2的亞細胞定位，例如入細胞核內(nèi)調(diào)節(jié)信號。在創(chuàng)傷條件下，RSK2細胞內(nèi)的具體機制與信號通路仍需要在下一步實驗中進行探索。

RSK2是p90核糖體蛋白s6激酶，其功能的調(diào)控往往與細胞的增殖、遷移與分化有關(guān)，而這也奠定了其在整個機體調(diào)控中所扮演的角色。本研究著重發(fā)現(xiàn)皮膚創(chuàng)面修復與RSK2的關(guān)系，闡明了RSK2對于皮膚成纖維細胞功能的調(diào)控作用，然而，創(chuàng)傷如何通過RSK2調(diào)節(jié)成纖維細胞的活化以及去活化，以及RSK2如何調(diào)控皮膚成纖維細胞仍屬未知。已有研究報道RSK2能夠應答生長因子，例如在類風濕性關(guān)節(jié)炎中，bFGF誘導的FGFR3-RSK2信號激活可能通過促進成纖維樣滑膜細胞的增殖與遷移和破骨細胞的生成從而起到關(guān)鍵作用[25]。YOO等[26]和HAMAOKA等[27]發(fā)現(xiàn)EGF能夠通過RSK2激活ELK3（ELK家族）或EphA2 （Eph受體酪氨酸激酶成員）從而調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖與轉(zhuǎn)化。而已有文獻報道bFGF與EGF均能夠促進皮膚的創(chuàng)面修復[28-29]，RSK2在創(chuàng)面修復中的作用是否與上述的信號存在相似的途徑尚不明確，仍需要進一步探索。而我們有理由相信，隨著科學技術(shù)不斷的發(fā)展，理論研究的不斷前進以及醫(yī)療水平的不斷提高，創(chuàng)面修復這一課題將會越來越完善，飽受創(chuàng)傷困擾的患者也將得到更好的醫(yī)治。