段海婧 ，馬 駿 △

（1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省中藥藥理與毒理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730000）

白血病(leukemia)是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病，其克隆中的白血病細(xì)胞增殖失控，分化障礙，凋亡受阻，停止在細(xì)胞發(fā)育的不同階段。在骨髓和其他造血組織中白血病細(xì)胞大量增生累積，并浸潤其他組織和器官，使正常造血受到抑制。白血病是中國十大高發(fā)惡性腫瘤之一，在惡性腫瘤病死率中，其居第6位（男性）和第8位（女性），在兒童及35歲以下成人中則居第1位，在我國急性白血病發(fā)病率較高[1]。目前，白血病的治療仍以化療為主，但是因?yàn)榇蠖鄶?shù)化療藥物十分昂貴且不具備靶向治療的特點(diǎn)，部分在治療白血病的同時還會產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副反應(yīng)。一些病人因?yàn)槟褪懿涣怂幬锏亩靖弊饔没蛞蚪?jīng)濟(jì)原因而放棄治療。隨著人們對生存質(zhì)量的重視，既有抗腫瘤作用，毒副作用又小且價格低廉的治療白血病的藥物，越來越受到人們的青睞。

天藍(lán)苜蓿，別名接筋草，以全草入藥，生于郊野曠地和路邊、田埂草叢中，多分布于東北、華北、西北、華中和西南各地。性甘、微澀，平，具有清熱利濕，涼血止血，舒筋活絡(luò)等功效。民間主要用于白血病，黃疸型肝炎，便血，痔瘡出血，坐骨神經(jīng)痛；風(fēng)濕骨痛，腰肌勞損等[2]。夏小軍的復(fù)方回生膠囊（天藍(lán)苜蓿、墓頭回等）在臨床用于治療小兒急性白血病具有顯著療效[3]，其中的主藥天藍(lán)苜蓿和墓頭回經(jīng)體外藥敏試驗(yàn)，具有抗急性白血病細(xì)胞的作用[4]。但有關(guān)天藍(lán)苜?？辜毙园籽〉乃幚碜饔醚芯课匆娢墨I(xiàn)報(bào)道。本文通過MTT法研究不同濃度的天藍(lán)苜蓿含藥血清對K562細(xì)胞增殖抑制的影響。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

80-1型離心機(jī) (金壇市恒豐儀器廠)；YZG/FZG系列真空干燥機(jī) (杭州錢江干燥設(shè)備有限公司)；MCO-15AC培養(yǎng)箱(日本SANYOElectric Biomedical Co., Ltd.)；安全柜；BIOZYMEⅢ酶標(biāo)儀(美國BIO RAD 公司)。

1.2 試劑

胎牛血清（浙江天杭生物科技股份有限公司）；青鏈霉素 (武漢普諾賽生命科技有限公司)；1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾科技有限公司)；MTT（Fluka公司）：二甲基亞砜(DMSO)。

1.3 藥材

天藍(lán)苜蓿于2015年7月采自甘肅省平?jīng)鍪嗅轻紖^(qū)，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室楊扶德教授鑒定為豆科苜蓿屬天藍(lán)苜蓿(MedicagolupulinaL.)地上部分。

1.4 動物和細(xì)胞

小鼠100只，體重20±2g，由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供；K562細(xì)胞，購自上海瓦蘭生物有限公司

2 方法

2.1 天藍(lán)苜蓿水煎液提取及配制

取天藍(lán)苜蓿地上部分干燥、粉碎。取藥物1000g，加 5000mL水煮沸 1h,去渣取汁，得水煎液3000mL，將殘?jiān)铀?000mL煎煮45min，去渣取汁，得水煎液4100mL,合并兩次水煎液，過濾濃縮，置于4℃冰箱保存，備用。

配制高劑量，給藥時用蒸餾水調(diào)整濃度為1g/mL，為高劑量。

配制中濃度(0.5g/mL)天藍(lán)苜蓿100ml，量取高濃度(1.0g/mL)天藍(lán)苜蓿煎膏液50mL，準(zhǔn)確用蒸餾水稀釋至100mL得到中濃度(0.5g/mL)天藍(lán)苜蓿煎膏液。量取中濃度(0.5g/mL)天藍(lán)苜蓿煎膏液40mL，用蒸餾水稀釋至80mL，得到低濃度(0.25g/mL)天藍(lán)苜蓿。

2.2 天藍(lán)苜蓿含藥血清的制備

小鼠100只，隨機(jī)分為空白對照組、天藍(lán)苜蓿水煎液高、中、低劑量組（實(shí)驗(yàn)組），每組25只，禁食不禁水過夜后，空白對照組每日灌服等體積蒸餾水，實(shí)驗(yàn)組每日分別灌服天藍(lán)苜蓿水煎液5、10、20 g/kg(劑量分別為臨床用量的 10、20、40 倍)，每日 2次(早晚進(jìn)食前灌胃)，連續(xù)給藥5天，于末次灌胃1h后無菌條件下心臟穿刺取血，3000rpm離心15min分離血清，0.22μm微孔濾膜，56℃，30min滅活。將空白血清和含藥血清冷凍干燥成凍干粉，分裝標(biāo)示后－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

K562細(xì)胞為懸浮液培養(yǎng)于含10%的胎牛血清，100U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的1640培養(yǎng)液中，置于37℃、5%CO2的飽和濕度的條件下培養(yǎng)，1～2d更換培養(yǎng)液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

2.4 用細(xì)自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測定細(xì)胞存活百分率

取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞,制備單細(xì)胞懸浮液并作適當(dāng)稀釋，取20uL細(xì)胞懸液與細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，在自動細(xì)胞計(jì)數(shù)儀上技術(shù)，測細(xì)胞成活率。并在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。

2.5 MTT法檢測天藍(lán)苜蓿含藥血清對細(xì)胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的K562細(xì)胞，調(diào)整濃度為5.0×105/mL，每孔90uL接種于96孔板。實(shí)驗(yàn)組加入天藍(lán)苜蓿高、中、低劑量含藥血清凍干粉1640培養(yǎng)液10uL使終濃度分別相當(dāng)于在體高、中、低劑量濃度），對照組加入等體積DMSOK562細(xì)胞為對照組，以不含細(xì)胞的培養(yǎng)基作為空白對照組，每組設(shè)3個平行孔，置于37℃、5%CO2的飽和濕度的條件下培養(yǎng) 24、48、72h 后，加入 20μLMTT（5mg/mL）繼續(xù)培養(yǎng) 4h，每孔加入150μLDMSO，輕輕震蕩10min，待結(jié)晶物完全溶解后，于酶標(biāo)免疫檢測儀上以測定波長為570nm波長處讀取各孔的吸光度（A）值。按公式計(jì)算細(xì)胞生長抑制率。

抑制率=｛（A陽性對照孔-A實(shí)驗(yàn)孔/A陽性對照孔-A空白孔｝×100%

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±s表示

3 結(jié)果

1）未經(jīng)藥物處理的細(xì)胞成活率98.6%

2）天藍(lán)苜蓿含藥血清對人白血病K562細(xì)胞凋亡形態(tài)的影響未經(jīng)藥物處理的對照組。K562細(xì)胞多呈圓形，經(jīng)不同濃度天藍(lán)苜蓿含藥血清處理后，均出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)，包膜皺縮，有泡狀突起及不規(guī)則凹陷，胞核染色質(zhì)濃縮，固縮，濃染，斷裂成小團(tuán)塊分散在胞膜周邊，以至形成凋亡小體。

3）天藍(lán)苜蓿含藥血清對人白血病K562細(xì)胞增殖的影響。不同濃度天藍(lán)苜蓿含藥血清作用K562細(xì)胞48h后，置于全自動連續(xù)光譜酶標(biāo)儀在570nm處測定A值。按公式：細(xì)胞存活率%=（加藥細(xì)胞A/對照A）×100%，從而得出天藍(lán)苜蓿含藥血清對K562細(xì)胞作用的半數(shù)抑制濃度（IC50）為0.8mol/L。

不同濃度天藍(lán)苜蓿含藥血清作用K562細(xì)胞24、48、72h后，置于全自動連續(xù)光譜酶標(biāo)儀在570nm處測定A值。見表1。

表1 天藍(lán)苜蓿含藥血清對白血病K562細(xì)胞增殖抑制率（%）

可見24h、48h和72h后，與對照組相比低、中、高三組隨劑量增加細(xì)胞存活率越低，有濃度依賴關(guān)系，各濃度間有顯著性差異（P＜0.05）。隨作用時間的延長，抑制作用增強(qiáng)，各時間段之間的差異有顯著性（P＜0.05），呈時間依賴關(guān)系。

4 討論

中醫(yī)認(rèn)為白血病屬 “虛勞”、“熱勞”、“濕病”、“癖積”、“痰核”、“血證”之范疇，發(fā)病原因是由于人體正氣虛弱，受到邪毒的侵襲，內(nèi)因外因相互作用而發(fā)??；七情內(nèi)傷、饑餓勞累、房事過度，損傷精髓、肝脾及三焦，使陰陽氣血、臟腑功能失調(diào)，正氣內(nèi)虛，復(fù)感六淫外邪或瘟毒而致病。過去，臨床上對于白血病的治療大都采用化療方法，其療效快，但副作用大，極易產(chǎn)生耐藥性，目前臨床多采用中藥與化療配合療法，中藥治療白血病的特點(diǎn)有：①中藥可增加化療敏感性；②中藥可對抗化療副作用，保護(hù)骨髓造血功能的恢復(fù)，防止化療藥物引起嚴(yán)重的骨髓抑制；③中藥可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡，④中藥可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞向正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化等[5]，且中藥藥源廣泛，價格低廉，宜長期服用等優(yōu)點(diǎn)，也是一般放、化療藥所不能相比的。因此，利用中藥、天然藥物抗白血病，配合化療和骨髓移植治療，己經(jīng)日益受到廣泛重視。

K562細(xì)胞株系人慢性髓細(xì)胞白血病急變細(xì)胞株，費(fèi)城染色體（Ph）陽性。在受到多種因素的誘導(dǎo)時，具有向紅系，單核系或巨核細(xì)胞分化的能力，是研究藥物作用、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞分化、基因轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)的良好靶細(xì)胞[6]，該細(xì)胞廣泛用于抗白血病作用的研究如：吳東等[7]以K562細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對象，研究小檗胺抗白血病作用；張啟國等[8]研究了藤黃酸對K562細(xì)胞的凋亡作用的誘導(dǎo)；易娟等[9]用K562細(xì)胞研究了小白菊內(nèi)酯抗白血病作用誘導(dǎo)凋亡是化療藥物抗白血病的重要機(jī)制。細(xì)胞凋亡是一種在基因控制下的細(xì)胞主動死亡過程，以核酸內(nèi)切酶活化后將DNA分解為180bp整倍數(shù)的片斷DNA為特征。形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)為細(xì)胞起泡，核固縮。天藍(lán)苜蓿含藥血清作用明顯，要抑制腫瘤細(xì)胞的生長。本研究采用MTT法觀察了天藍(lán)苜蓿含藥血清對人白血病K562細(xì)胞增殖有抑制作用，其IC50值為0.8mol/L，顯示出天藍(lán)苜蓿含藥血清對K562細(xì)胞有殺傷作用。人白血病K562細(xì)胞經(jīng)天藍(lán)苜蓿含藥血清處理后，細(xì)胞均出現(xiàn)明顯凋亡形態(tài)，胞膜皺縮，胞核固縮，濃染，斷裂成小團(tuán)塊分散在胞膜周邊，以致形成凋亡小體。用不同濃度天藍(lán)苜蓿含藥血清處理白血病細(xì)胞株K562，24、48、72h后，發(fā)現(xiàn)呈時間和劑量依賴關(guān)系，因此，后續(xù)實(shí)驗(yàn)建議使用高劑量。