李 亞, 韓 穎, 楊 斌, 趙 寧,

(1.西南林業(yè)大學生命科學學院，云南 昆明 650224；2.西南林業(yè)大學云南省森林災害預警與控制重點實驗室，云南 昆明 650224)

云南省是我國核桃生產(chǎn)大省，核桃產(chǎn)業(yè)是促進云南地區(qū)發(fā)展的主導產(chǎn)業(yè)[1].截至2018年底，云南省核桃產(chǎn)量已達116萬t，綜合產(chǎn)值達318億元，其產(chǎn)值和產(chǎn)量均居世界前列[2].云南省因其豐富的地勢條件具有多種核桃栽培品種，包括漾濞大泡核桃、三臺核桃、細香核桃等為主的泡核桃品種，娘青核桃、桐子果等為主的夾綿核桃，以及云新系列雜交選育品種[3-4].

核桃黃單胞桿菌(Xanthomonasarboricolapv. Juglandis)是引起核桃細菌性黑斑病的主要病原菌，大量研究表明，植物的品種抗病性與植物的生理生化指標變化有關[5-8].董玉峰等[9]發(fā)現(xiàn)感病品種的楊樹感染潰瘍病后，其體內(nèi)單寧含量比抗病品種低；劉蘭玉[10]發(fā)現(xiàn)感病品種的板栗感染板栗膏藥病時，其糖含量比抗性品種高.部分生理指標已明確可以作為抗性評價指標，如可溶性糖可用于評價由腐皮鐮刀菌引起的核桃根腐病抗病性[11]；單寧可以作為油茶炭疽病抗病性評價的指標[12]；鄭磊等[13]發(fā)現(xiàn)杧果受細菌性角斑病菌侵染的短期內(nèi)，其體內(nèi)可溶性糖、可溶性蛋白和丙二醛等生理指標會發(fā)生顯著變化以誘導植物體產(chǎn)生抗性抵御脅迫環(huán)境.由此可見，植物體內(nèi)的一些生理生化指標與植物抗性有一定的關系.

研究寄主植物受病原菌侵染后的生理生化變化，對揭示病原菌致病機制、植物抗性生理基礎有著重要意義.已有研究表明，核桃接種黃單胞桿菌后，體內(nèi)抗性酶和酚類化合物的變化可用于判定品種與黑斑病易感性的關系[14-15].但是測試抗性酶和酚類化合物的體系不僅復雜，而且所需儀器較為昂貴，一線生產(chǎn)單位難以實現(xiàn).因此，本研究選取大泡核桃、三臺核桃、扎343、云新云林4個核桃品種為材料，研究接種核桃黃單胞桿菌后各核桃品種的發(fā)病情況及可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和單寧含量的變化，分析不同品種核桃生理指標變化與抗性的相關性，旨在建立一種簡單易操作的核桃對黑斑病抗性的鑒定方法，為早期鑒定核桃品種的抗病性提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株：核桃黃單胞桿菌X.boricolapv. juglandis，由西南林業(yè)大學生物化學教研室分離純化并保存，菌株號QLDAfr-119.

供試植株：大泡核桃、三臺核桃、云新云林、扎343嫁接苗各20棵，由云南省大理白族自治州林業(yè)科學研究所核桃種質(zhì)資源庫提供.

1.2 菌株制備及侵染

菌懸液制備：將活化的核桃黃單胞桿菌接種于NA培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)5～7 d后挑取適量菌體融于無菌水中，配制成1×107cfu·mL-1的菌體懸浮液待用.

病原菌的接種：選取健康無病害、長勢相同的2 a生大泡核桃、三臺核桃、云新云林、扎343核桃嫁接苗各20棵，選擇同一部位枝條上的葉片，用滅菌接種針刺相同數(shù)量、相同面積的針孔，其中10棵在葉片針刺部位覆蓋噴灑了核桃黃單胞桿菌菌懸液的無菌棉球，另外10棵在針刺部位覆蓋噴灑了無菌水的無菌棉球作為對照，保濕處理24 h后取下棉球.每天觀察記錄葉片發(fā)病情況及病斑面積，并在接種后的第0、5、10、15、20、25、30 d采摘各處理組及對照組葉片測其生理生化指標，做3個生物學重復.

1.3 抗病性評價方法

根據(jù)接種病原菌后統(tǒng)計的不同時期的葉片病斑面積和數(shù)量，計算出相應的病情指數(shù).

其中病害分級標準參照賀占雪等[16]的分級標準，在其基礎上適當改進，根據(jù)病斑面積占比將病級分成4級：0級、無病癥；1級、病斑面積<5%，2級、5%<病斑面積占葉面積≤25%；3級、25%<病斑面積占葉面積≤50%；4級、病斑面積>50%.

以病情指數(shù)為基礎，對不同品種的核桃進行抗病性評價分析.參照王瑜等[17]抗病性等級劃分標準并結合病情指數(shù)將抗病性等級分為4類：抗病、病情指數(shù)<5；中抗、5≤病情指數(shù)≤15；中感、15<病情指數(shù)≤25；感病、病情指數(shù)>25.

1.4 生理生化指標測定

可溶性糖含量的測定參照趙軼鵬等[18]采用的蒽酮比色法；可溶性蛋白含量的測定參考趙英永等[19]采用的考馬斯亮藍法；脯氨酸含量的測定參考張瑛等[20]采用的磺基水楊酸提取核桃嫩葉中游離脯氨酸的方法；單寧含量測定參考玄立春等[21]采用的鎢酸鈉比色法.

1.5 數(shù)據(jù)分析處理方法

利用Excel 2010進行數(shù)據(jù)處理，利用SPSS 22.0使用LSD多重比較方法進行顯著性檢驗并利用Pearson相關系數(shù)進行相關性分析.

2 結果與分析

2.1 4個核桃品種接種核桃黃單胞桿菌后的抗病性

由表1可得，4個品種核桃接種核桃黃單胞桿菌后發(fā)病情況差異顯著.大泡核桃和三臺核桃在接種20 d后才出現(xiàn)病斑，病級為1級，表現(xiàn)為抗病品種；云新云林和扎343在接種10 d后就有明顯的病斑出現(xiàn)，且扎343發(fā)病程度較高，30 d后病斑面積達到98.78 mm2.接種30 d時，云新云林和扎343的發(fā)病率分別為50%和60%，病情指數(shù)均大于25，均表現(xiàn)為感病品種.

表1 4個品種核桃接種核桃黃單胞桿菌后抗病等級

2.2 核桃黃單胞桿菌對核桃可溶性糖含量的影響

由圖1可知，4個品種的核桃在接種前可溶性糖含量差異不顯著(P>0.05)，接種病原菌后可溶性糖含量均呈上升趨勢，第20 d到達峰值后開始下降.受感染葉片的可溶性糖含量均高于對照組，抗性品種的可溶性糖含量持續(xù)低于感病品種，即扎343>云新云林>大泡核桃>三臺核桃.受病原菌侵染20 d后，感病品種的可溶性糖含量較對照組平均升高了16.85 mg·g-1，而抗性品種平均增量僅為2.3 mg·g-1.接種病原菌30 d后，抗性品種的可溶性糖含量比感病品種平均低了45.92%.扎343和三臺核桃在試驗期內(nèi)均存在極顯著差異(P<0.01).

2.3 核桃黃單胞桿菌對核桃可溶性蛋白含量的影響

由圖2可知，4個品種的核桃在接種前可溶性蛋白含量存在顯著差異(P<0.05)，扎343及其對照顯著高于其他處理組；接種病原菌后可溶性蛋白含量均呈下降趨勢，10 d后開始緩慢回升，各對照組的可溶性蛋白含量低于處理組；接種30 d后抗病品種的可溶性蛋白含量比感病品種平均低了63.40%，其含量差異是抗性品種的1.73倍.扎343的處理組和對照組在試驗期內(nèi)與其他3個品種間差異顯著(P<0.05)，可溶性蛋白含量：扎343>云新云林>大泡核桃>三臺核桃.

2.4 核桃黃單胞桿菌對核桃脯氨酸含量的影響

由圖3可得，抗性品種的脯氨酸含量顯著高于感病品種(P<0.05)，在接種病原菌20 d后，含量差距高達242.02 μg·g-1，三臺核桃的脯氨酸含量與感病品種間差異極顯著(P<0.01)；接種30 d后感病品種的脯氨酸含量比抗病品種平均少了67.33%，含量差異是感病品種的2.06倍.整個試驗期內(nèi)，不同品種核桃葉片內(nèi)脯氨酸含量變化均呈下降—上升—下降的趨勢，且對照組的脯氨酸含量始終低于處理組.

2.5 核桃黃單胞桿菌對核桃單寧含量的影響

由圖4可得，接種病原菌之后所有品種核桃的單寧含量都有不同程度的上升，除扎343及其對照組，其他品種核桃的單寧含量在接種10 d后達到峰值，其含量為三臺核桃>大泡核桃>云新云林>扎343；整個試驗期內(nèi)，所有品種核桃單寧含量的變化趨勢一致.抗性品種的單寧含量始終高于感病品種，接種30 d后感病品種比抗病品種單寧含量少了52.44%，含量差異是感病品種的1.1倍，感病和抗性品種差異顯著(P<0.05).

2.6 核桃品種抗性與生理生化指標的相關性

由表2可得，不同品種核桃的抗性和可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸、單寧含量間存在極顯著相關，可溶性糖和可溶性蛋白含量與品種抗性間存在極顯著的負相關(P<0.01)；脯氨酸和單寧含量與品種抗性間存在極顯著正相關(P<0.01)；除可溶性糖含量與接種時間存在顯著正相關外(P<0.05)，其他生理指標與接種時間之間沒有相關性.另外，核桃黃單胞桿菌的接種時間與病情指數(shù)間為極顯著正相關，而品種抗性與病情指數(shù)間為極顯著負相關關系.

表2 4個核桃品種處理時間、生理指標和品種抗性的相關性1)

1)*P<0.05；**P<0.01.

3 討論

本研究中不同品種核桃對黃單胞桿菌抗性與可溶性糖含量成負相關，變化趨勢與不同油菜品種對菌核病抗病性差異及關系基本一致[22].可溶性糖在植物體內(nèi)主要參與呼吸代謝以及為保護性物質(zhì)合成提供原料[23].受病原菌侵染時，植物細胞壁分解，可溶性糖含量升高，因此本研究中4個品種的核桃在受到病原菌侵染后，植物體內(nèi)可溶性糖含量都有不同程度的升高.其中抗性品種可溶性糖含量比感病品種低了45.92%(圖1)，是由于感病品種的受損更嚴重，細胞壁分解程度更高.受病原菌侵染20 d后，可溶性糖含量開始下降，這是由于植物體內(nèi)的可溶性糖被病原菌利用，或者被機體的呼吸作用消耗.

可溶性蛋白是參與機體滲透調(diào)節(jié)活動的重要營養(yǎng)物質(zhì)，常作為評價品種抗性的指標[24].本研究中4個品種的核桃受到病原菌侵染后，葉片可溶性蛋白含量均呈下降趨勢，與花生接種瘡痂病菌后可溶性蛋白與品種抗性間的負相關關系一致[25].植物通過降解可溶性蛋白以參與抗病物質(zhì)的合成，增強抗病性.受核桃黃單胞桿菌侵染20 d后，感病品種的可溶性蛋白含量開始升高，抗性品種的可溶性蛋白含量比感病品種少了63.4%(圖2)，這是由于病原菌的侵染促使了植物的氮代謝，為病原菌生長提供能量，使得病原菌更容易入侵[22]，而抗病品種能夠繼續(xù)降解可溶性蛋白以保持抗性.

本研究中4個品種的核桃受到病原菌侵染后，葉片的脯氨酸含量有不同程度的升高，與核桃抗性呈正相關，感病品種的脯氨酸含量比抗性品種少了67.33%(圖3)，與大豆抗腐霉根腐病時脯氨酸含量顯著升高的趨勢一致[26].植物體受病原菌侵染時，抗性品種能夠快速產(chǎn)生脯氨酸以減輕滲透失衡引起的各類酶蛋白變性，通過調(diào)節(jié)滲透壓來抵御脅迫環(huán)境，發(fā)揮抗性作用[27].感病品種由于脯氨酸的積累效率較低，體內(nèi)滲透平衡遭到破壞，使得病原菌更容易入侵.

植物可通過調(diào)節(jié)次生代謝產(chǎn)物含量來應對逆境脅迫，如提高單寧含量來增強抵抗力[28].本研究中不同品種核桃的抗性與單寧含量呈極顯著正相關(P<0.01)，受病原菌侵染后單寧含量顯著升高，且感病品種的單寧含量比抗病品種低了52.44%(圖4).單寧是一種有效的防護劑，當細胞受損時，植物可以分泌多酚氧化物將單寧氧化成具有毒性的單寧，以抵御病原菌的生長.抗性品種能及時分泌大量單寧來抵御病原菌，而感病品種合成單寧的效率較低，不能及時抑制病原菌的生長[29-30].

不同抗性品種核桃樹接種黃單胞桿菌后，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和單寧的含量較對照組均有不同程度的增加，抗性品種體內(nèi)的脯氨酸和單寧含量在接種病原菌前后都維持在一個較高的水平，而感病品種體內(nèi)的脯氨酸和單寧含量較低，單寧和脯氨酸含量與品種抗性間存在積極的正相關關系.感病品種接種病原菌前后可溶性糖和可溶性蛋白含量都高于抗性品種，同一指標抗性品種和感病品種的變化趨勢也大致相同，且感病品種扎343的增加幅度顯著高于抗性品種，說明病原菌會誘導感病品種中可溶性糖和可溶性蛋白含量的升高更加顯著，可溶性糖和可溶性蛋白含量與核桃品種抗性間存在極顯著負相關關系.

綜上所述，可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸和單寧的含量可以作為衡量核桃品種抗性的指標，為核桃優(yōu)良種質(zhì)資源選育提供理論依據(jù).