葉兵兵　季生奇　楊誠潔　肖航　陳青云　周瀅

摘要：以2019年春防后的雞作為檢測(cè)對(duì)象，運(yùn)用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗(yàn)檢測(cè)康定市某3家養(yǎng)殖場(chǎng)和某2家交易市場(chǎng)的樣本中H5亞型禽流感及新城疫抗體水平。5個(gè)采樣點(diǎn)各采集12個(gè)樣本，共采樣60個(gè)。結(jié)果表明，該5個(gè)采樣點(diǎn)的H5亞型禽流感及新城疫抗體離散度較高，但是抗體水平合格率均達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)。

關(guān)鍵詞：禽流感;新城疫;抗體;康定市

中圖分類號(hào)：S858.31? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? ? ? 文章編號(hào)：1007-273X（2020）05-0011-02

H5亞型禽流感是影響世界各地家禽的主要疫病，世界衛(wèi)生組織（OIE）將其列為依法通報(bào)的動(dòng)物疫病，同時(shí)也是我國的一類動(dòng)物疫病， H5亞型禽流感是我國強(qiáng)制免疫和監(jiān)測(cè)的疫病[1]。新城疫也是我國的一類動(dòng)物疫病，由于感染的雞群在呼吸系統(tǒng)、消化系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等都能引起強(qiáng)烈病變，也稱為“雞瘟”，不同季節(jié)、不同品種和不同日齡的雞都易感[2]。為了調(diào)查四川省康定市家禽對(duì)H5亞型禽流感、新城疫的抵抗能力，在2019年春防后，選擇了家禽相對(duì)集中的3家養(yǎng)殖場(chǎng)和2家交易市場(chǎng)進(jìn)行隨機(jī)抽樣調(diào)查。評(píng)價(jià)家禽的疫病抵抗能力，為進(jìn)一步的疾病防控工作提供科學(xué)依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 試劑

禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原（哈爾濱維科生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：2018008）。雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原（青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，生產(chǎn)批號(hào)：010131801）。禽流感病毒H5亞型陽性血清（哈爾濱維科生物有限公司，生產(chǎn)批號(hào)：2016003）。雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)陽性血清（青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，生產(chǎn)批號(hào)：010151802）。SPF雞陰性血清（青島立見診斷技術(shù)發(fā)展中心，生產(chǎn)批號(hào)：20180301）。

自配1%雞紅細(xì)胞懸液：由于不同個(gè)體的雞紅細(xì)胞對(duì)病毒敏感性存在差異，所以共采取3羽健康成年公雞的血液，重復(fù)制作3個(gè)1%雞紅細(xì)胞懸液，將3個(gè)懸液混合后4 ℃保存?zhèn)溆肹3]。

1.2? 器材

SC-04型低速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)有限公司;DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科技有限公司;2W-H型振蕩器，常州澳華儀器有限公司;DY20659型加樣器（5～50 uL），大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器有限公司;一次性96孔V型（110°）反應(yīng)板。

1.3? 樣本采集

1.3.1? 血液樣本采集? 在采血前準(zhǔn)備采血工具，包括酒精棉球、干棉球、一次性5 mL真空采血管、針頭、記號(hào)筆、標(biāo)簽、裝有冰袋的泡沫箱。通過雞翅下靜脈采血，共采集5組樣品。A、B、C組樣本采集于康定市某3家養(yǎng)殖場(chǎng)，每組各12羽;D、E組樣本采集于康定市某2家活禽交易市場(chǎng)，每組各12羽，樣本共計(jì)60個(gè)。

1.3.2? 血清試樣制備? 將采集的血液樣本斜面靜置12 h，待血清析出。將析出的血清緩緩注入新的1 mL滅菌離心管中，注意不要注入凝血塊。血清顏色呈淺黃色、半透明較好，用記號(hào)筆做好標(biāo)記備檢[4]。

1.4? 抗體檢測(cè)方法及試驗(yàn)步驟

1.4.1? 抗體檢測(cè)方法? 禽流感抗體檢測(cè)依據(jù)中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 1182—2010 禽流感檢疫技術(shù)規(guī)范）進(jìn)行血凝試驗(yàn)與血凝抑制試驗(yàn)[5]。新城疫抗體檢測(cè)依據(jù)中華人民共和國出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（SN/T 0764—2011 新城疫檢疫技術(shù)規(guī)范）進(jìn)行血凝試驗(yàn)和血凝抑制試驗(yàn)[6]。

1.4.2? 試驗(yàn)步驟

（1）血凝試驗(yàn)（HA）測(cè)定抗原的血凝價(jià)。在微量反應(yīng)板的1～12孔各加入25 μL生理鹽水;換滴頭，吸取25 μL的抗原加入到第1孔，然后倍比稀釋至11孔，并棄去剩下的25 μL;換滴頭，每孔再加入25 μL的生理鹽水，混勻后，每孔加入25 μL的1%雞紅細(xì)胞懸液;振蕩混勻，室溫靜置30 min后觀察結(jié)果。HA試驗(yàn)的判定方法：將板傾斜，觀察紅細(xì)胞有無呈淚滴狀流淌。完全血凝（不流淌）的抗原最高稀釋倍數(shù)代表一個(gè)血凝單位（HAU）。測(cè)得禽流感病毒H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原的血凝價(jià)為7log2;雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原的血凝價(jià)為8log2。

（2）血凝抑制試驗(yàn)（HI）測(cè)定血清中的抗體滴度。根據(jù)HA試驗(yàn)配制4HAU抗原，H5亞型血凝抑制試驗(yàn)抗原進(jìn)行1∶2稀釋配制[5];雞新城疫血凝抑制試驗(yàn)抗原進(jìn)行1∶2稀釋配制[6]。

在微量反應(yīng)板上的第1～11孔各加入25 μL生理鹽水，第12孔加50 μL生理鹽水;吸取25 μL待檢血清加入到第1孔內(nèi)，充分混勻后倍比稀釋至第10孔;在第1孔至11孔加入25 μL的4HAU，室溫靜置30 min;然后每孔加入25 μL的1%雞紅細(xì)胞懸液，振蕩混勻，室溫靜置30 min后觀察結(jié)果。以完全抑制4HAU抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度。陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽性對(duì)照孔血清誤差不超過1log2，試驗(yàn)有效。

2? 結(jié)果與分析

抗體合格標(biāo)準(zhǔn)：禽流感抗體水平≥4log2;新城疫抗體水平≥5log2[7]。

由表1可知，該地H5亞型禽流感抗體水平為（5～10）log2，抗體水平合格率為100%（禽流感抗體水平≥4log2），達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（合格率≥70%）。各采樣點(diǎn)的抗體水平標(biāo)準(zhǔn)差為（1.1～1.6）log2，平均（6.8～7.4）log2，CV值15.6%～21.1%，抗體離散度較高[8]。

由表2可知，該地新城疫抗體水平為（5～10）log2，抗體水平合格率為100%（新城疫抗體水平≥5log2），達(dá)到國家標(biāo)準(zhǔn)（合格率≥70%）。各采樣點(diǎn)的抗體水平標(biāo)準(zhǔn)差為（1.1～1.5）log2，平均（7.0～7.8）log2，CV值15.6%～21.1%，抗體離散度較高。

3? 小結(jié)與討論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，5個(gè)采樣點(diǎn)的H5亞型禽流感、新城疫抗體水平離散度較高，但是抗體水平合格率均達(dá)到國家了標(biāo)準(zhǔn)，表明康定市家禽對(duì)H5亞型禽流感、新城疫有一定的抵抗力，但是抗體水平較低的雞感染疫病幾率較大。通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，康定市海拔較高、光照充足，在一定程度上限制了疫病的發(fā)生。由于地貌氣候復(fù)雜多樣，康定市家禽養(yǎng)殖業(yè)還處于以農(nóng)戶散養(yǎng)為主，大多養(yǎng)殖戶未形成科學(xué)的飼養(yǎng)管理理念。本次調(diào)查中，大多數(shù)養(yǎng)殖戶不愿配合樣品的采集，給調(diào)查帶來了困難，導(dǎo)致試驗(yàn)樣本不充分，只能在一定程度上反映康定市家禽對(duì)H5亞型禽流感、新城疫的抗病能力。

參考文獻(xiàn)：

[1] 錢昌銀，程曉峰，劉? 華，等.2017年安徽省合肥市禽流感抗體檢測(cè)[J].中國動(dòng)物檢疫，2018，35（12）：26-28.

[2] 張勃偉，王俊全，楊永倩，等.渭南市某海蘭褐蛋雞場(chǎng)蛋雞新城疫抗體水平的檢測(cè)及分析[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，64（11）：45-48.

[3] 李? 麗.血凝和血凝抑制試驗(yàn)中制備紅細(xì)胞懸液的幾點(diǎn)體會(huì)[J].甘肅畜牧獸醫(yī)，2015（6）：25-28.

[4] 張萬林.淺談雞血清采集存在問題及對(duì)策[J].中國畜牧種禽業(yè)，2016（11）：130-131.

[5] SN/T 1182—2010，禽流感檢疫技術(shù)規(guī)范[S].

[6] SN/T 0764—2011，新城疫檢疫技術(shù)規(guī)范[S].

[7]王娟娟.2014年柳城縣畜禽主要疫病免疫抗體水平監(jiān)測(cè)及分析[D].南寧：廣西大學(xué)，2016.

[8] 鄭藝杰.龍海市雞新城疫免疫抗體水平調(diào)查[J].中國畜禽種業(yè)，2017（8）：5-6.