田衛(wèi)政

摘 要：本文建立了準(zhǔn)確、快速檢測(cè)飲料及發(fā)酵酒中紐甜含量的高效液相色譜方法。選用有代表性的果汁（漿）類飲料、發(fā)酵酒、風(fēng)味飲料、含乳飲料及植物蛋白飲料共5種基質(zhì)，用混合提取液提取，定容后過(guò)濾上機(jī)測(cè)試，蛋白含量較高的樣品在提取后中加入蛋白沉淀劑凈化后定容過(guò)濾待上機(jī)測(cè)試。選用Shimadzu VP-ODS（4.6 mm×150 mm，4.6 μm）色譜柱，218 nm檢測(cè)波長(zhǎng)，進(jìn)樣量20 μL，離子對(duì)試劑和乙腈為混合流動(dòng)相，用優(yōu)化后的色譜梯度條件進(jìn)行洗脫。結(jié)果顯示，紐甜在0.206～103.0 μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.38%。在1.03～103 mg·L-1加標(biāo)水平下，回收率在98.7%～108.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.7%～4.5%。方法定量限為0.3 mg·kg-1。試驗(yàn)結(jié)果顯示優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量飲料類樣品及發(fā)酵酒中紐甜含量。

關(guān)鍵詞：紐甜;飲料;發(fā)酵酒;快速檢測(cè)

Abstract：In order to detect neotame content in different types of beverages and fermentation wine by HPLC rapidly and accurately， the optimized testing method was built in this paper. Fruit juice， fermentation wine， flavor drink， young drink and vegetable protein drink were chosen as experiment materials. After being extracted by solution and filtrated， the sample solutions were ready for testing by HPLC. Samples with high protein content were added with protein precipitator and the other processing steps were same as the previous item. Shimadzu VP-ODS （4.6 mm×150 mm， 4.6 μm） was selected as chromatographic column， acetonitrile and ion pair solution were selected as moving phase to test sample solutionsaccording to the optimizedelution procedureat 218 nm wave length. And the injection volume was 20μL. Results showed that the linearity of neotame between 0.206 μg·mL-1 and 103.0 μg·mL-1 accorded with the standard code. RSD of accuracy was 0.38%. Recovery rate was between 98.7% and 108.1% within the scope of 1.03～103 mg·L-1 while RSD of recovery rate was between 1.7% and 4.5%. Limit of quantitation was 0.3 mg·kg-1. The evaluation indexes showed the optimized testing method meet the detection requirements.

Key words：Neotame; Beverage; Fermentation wine; Rapid detection

食品添加劑是現(xiàn)代食品工業(yè)發(fā)展的產(chǎn)物。食品添加劑的發(fā)展對(duì)拓展食品種類、保持食品品質(zhì)、延長(zhǎng)貨架期有重要影響。食品的風(fēng)味由色、香、味、形（質(zhì)構(gòu)）等構(gòu)成。甜味是各類食品風(fēng)味的基礎(chǔ)，具有協(xié)調(diào)調(diào)整平衡風(fēng)味、掩蔽異味、增強(qiáng)口感的重要作用[1]。因此甜味劑是食品添加劑中的重要的分支。根據(jù)GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》規(guī)定管理的甜味劑，分為天然甜味劑和人工合成的甜味劑[2]。其中天然甜味劑包括蔗糖、葡萄糖、糖醇為主的糖的衍生物和非糖類天然甜味劑。人工合成甜味劑是指采用化學(xué)合成及改性等方法得到的各類人工甜味劑。如糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、紐甜等[3]。

紐甜學(xué)名為N-[N-（3，3-二甲基丁基）]-L-α-天門冬氨-L-苯丙氨酸1-甲酯，是一種功能性甜味劑。甜度為蔗糖的8 000倍，甜蜜素的300倍，阿斯巴甜的40倍。能量值幾乎為零。甜味純正和諧，沒(méi)有苦味及其他后味。紐甜在體內(nèi)代謝后形成脫酯化的紐甜和微量甲醇，其代謝物在血液中存留時(shí)間較短，最后從糞便和尿液排出體外。穩(wěn)定的性狀和安全性使得紐甜在食品加工行業(yè)應(yīng)用越來(lái)越廣泛，尤其以飲料中應(yīng)用較為普遍。紐甜的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法是樣品提取后經(jīng)固相萃取等前處理對(duì)樣品進(jìn)行凈化，過(guò)程較為復(fù)雜繁瑣，不利于批量檢測(cè)[4]。目前紐甜含量的測(cè)定主要是應(yīng)用高效液相色譜法，通過(guò)特征吸收波長(zhǎng)下的吸光度計(jì)算濃度[5-9]。本研究對(duì)樣品前處理以及液相梯度洗脫程序進(jìn)行優(yōu)化，旨在獲取一套應(yīng)用于飲料類產(chǎn)品及發(fā)酵酒產(chǎn)品簡(jiǎn)單易操作的紐甜檢測(cè)方法，為紐甜批量化樣品的快速檢測(cè)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料試劑及儀器

1.1.1 材料及主要試劑

A：果汁類、B：發(fā)酵酒、C：風(fēng)味飲料、D：含乳飲料、F：植物蛋白飲料，共5種（均為市售）;紐甜標(biāo)準(zhǔn)品C20H30N2O5，CAS號(hào)：165450-17-9、純度100.0%（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）;辛烷磺酸鈉（色譜純）。

1.1.2 儀器

分析天平[梅特勒-托利多國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司];離心機(jī)（賽默飛世爾科技有限公司）;渦旋振蕩器（賽默飛世爾科技有限公司）;超聲機(jī)（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司）;配有二級(jí)管陣列檢測(cè)器的高效液相色譜儀（島津儀器設(shè)備有限公司）

1.2 方法

1.2.1 試劑配制

（1）混合提取液。分別吸取0.8 mL、2.5 mL三乙胺，用水定容至1 000 mL，pH約為4.5。

（2）離子對(duì)試劑緩沖液。稱取2.00 g辛烷磺酸鈉，用500 mL超純水溶解，加入1.0mL磷酸，加水定容至1 000 mL。

（3）亞鐵氰化鉀（92 g·L-1）。稱取10.6 g亞鐵氰化鉀[K4Fe（CN）6·3H2O]，加入適量水溶解，用水定容至100 mL。

（4）乙酸鋅溶液（183 g·L-1）。稱取22 g乙酸鋅[Zn（CH3COO）2·2H2O]，加入3 mL冰乙酸，用水定容至100 mL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

（1）紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液配制。稱取紐甜標(biāo)準(zhǔn)品100.30 mg（純度為100.0%）至10 mL容量瓶中，用混合提取液定容，紐甜含量為10.30 mg·mL-1。

（2）紐甜標(biāo)準(zhǔn)曲線配制。吸取1 mL紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至10 mL容量瓶中，用混合提取液定容，得紐甜含量為1.030 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)中間液。吸取標(biāo)準(zhǔn)中間液2、50、100、500 μL和1 000 μL，用上述混合提取液定容至10 mL，配制成濃度為0.206、5.15、10.30、51.5 μg·mL-1和103.0 μg·mL-1的系列工作溶液。

1.2.3 樣品提取及凈化

（1）果汁（漿）類飲料及風(fēng)味飲料。吸取試樣10 mL于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL混合提取液，渦旋振蕩10 min，水浴超聲30 min，4 000 r·min-1離心8 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用混合提取液定容?；靹蚝筮^(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

（2）發(fā)酵酒。將樣品超聲20min除去氣泡。吸取試樣10 mL于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL混合提取液，渦旋振蕩10 min，水浴超聲30 min，4 000 r·min-1離心8 min后上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用混合提取液定容?；靹蚝筮^(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

（3）含乳飲料及植物蛋白飲料。吸取試樣10 mL于50 mL具塞塑料離心管中，加入20 mL混合提取液，渦旋振蕩10 min，水浴超聲30 min，加入蛋白沉淀劑亞鐵氰化鉀溶液（92 g·L-1）2 mL和乙酸鋅溶液（183 g·L-1）2 mL，混勻，將樣品在4 000 r·min-1離心8 min，取上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，于固體殘?jiān)屑尤胩崛∫?0 mL，渦旋振蕩后超聲10 min，于4 000 r·min-1離心8 min，將上清液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，并用混合提取液定容至刻度，混勻后過(guò)0.22 μm濾膜，待液相色譜測(cè)定。

1.2.4 色譜條件選擇

色譜柱：Shimadzu VP-ODS柱（4.6 mm×150 mm，4.6 μm）;二極管陣列檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)218 nm;進(jìn)樣量20 μL;流速1.5 mL·min-1。

流動(dòng)相：A相為乙腈;B相為離子對(duì)緩沖溶液。通過(guò)調(diào)整兩項(xiàng)洗脫條件，獲取良好的峰形和基線分離，見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 紐甜檢測(cè)波長(zhǎng)

利用二極管陣列檢測(cè)器（PDA）對(duì)紐甜標(biāo)準(zhǔn)品溶液在波長(zhǎng)190～300 nm范圍內(nèi)掃描，結(jié)果顯示，在190～205 nm范圍內(nèi)，隨著波長(zhǎng)增加，紐甜含量下降迅速，在205～300 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)，以218 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下，響應(yīng)最高見(jiàn)圖1。由于200 nm以下的光可以被溶劑（如水，有機(jī)溶劑等）強(qiáng)烈吸收，測(cè)試結(jié)果誤差很大，不能應(yīng)用于檢測(cè)。因此，選定218 nm作為紐甜的檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2 校準(zhǔn)曲線

紐甜校準(zhǔn)曲線如圖2。紐甜標(biāo)準(zhǔn)品的回歸方程為Y=4 090.16X+5 076.00，結(jié)果表明紐甜在0.206～103.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r為0.999 95。

為果汁（漿）類、風(fēng)味飲料、含乳飲料、植物蛋白飲料等飲料類及發(fā)酵酒樣品準(zhǔn)確定量提供依據(jù)。

2.3 精密度試驗(yàn)

取濃度為5.15 μg·mL-1的紐甜標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次。通過(guò)計(jì)算目標(biāo)峰峰面積RSD評(píng)定方法精密度。紐甜標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖如圖3，精密度結(jié)果如表2。由圖3知，目標(biāo)化合物紐甜在6.75 min出峰，峰形對(duì)稱，接近高斯分布。由表2知，該方法峰面積相對(duì)偏差RSD為0.38%，該方法精密度符合檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)要求。標(biāo)準(zhǔn)品平均濃度為5.09 μg·mL-1，擬合度為98.8%，得出該方法有較高準(zhǔn)確度。

2.4 方法定量限

根據(jù)儀器噪音的10倍確定定量限。對(duì)儀器信號(hào)值平行測(cè)定20次的信號(hào)強(qiáng)度，紐甜的定量限為0.3 mg·kg-1。

2.5 樣品測(cè)定

取上述5類飲料樣品，分別編號(hào)A：果汁、B：發(fā)酵酒、C：風(fēng)味飲料、D：含乳飲料、E：植物蛋白飲料，每種樣品按照本文優(yōu)化的方法進(jìn)行提取純化處理后上機(jī)測(cè)試，結(jié)果如表3。

2.6 回收率試驗(yàn)

準(zhǔn)確量取10.0 mL試樣于50 mL具塞塑料離心管中，加入濃度為103.0 μg·mL-1的紐甜標(biāo)準(zhǔn)品工作液100 μL作為J-1組加標(biāo)樣品;加入濃度為1.030 mg·mL-1的紐甜標(biāo)準(zhǔn)中間液100 μL作為J-2組加標(biāo)樣品;加入濃度為10.30 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液100 μL作為即J-3組加標(biāo)樣品，按照優(yōu)化過(guò)的樣品處理方法每個(gè)加標(biāo)濃度平行處理6份上機(jī)測(cè)試。

2.6.1 果汁及風(fēng)味飲料3水平加標(biāo)結(jié)果

果汁加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖4，風(fēng)味飲料加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖5;果汁及風(fēng)味飲料回收率見(jiàn)表4。由圖4看出，果汁基質(zhì)中的紐甜峰形對(duì)稱，基線分離度高。由圖5看出，風(fēng)味飲料基質(zhì)中的紐甜峰形對(duì)稱，基線分離度高。由表4看出，果汁基質(zhì)加標(biāo)回收率在100.2%～103.7%;回收率相對(duì)偏差RSD在1.7%～3.3%范圍;風(fēng)味飲料基質(zhì)加標(biāo)回收率在98.7%～104.9%，回收率相對(duì)偏差RSD在1.9%～2.2%?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[10]。優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量果汁基質(zhì)和風(fēng)味飲料基質(zhì)中紐甜含量。

2.6.2 發(fā)酵酒3水平加標(biāo)結(jié)果

發(fā)酵酒3水平加標(biāo)結(jié)果，發(fā)酵酒加標(biāo)樣品色譜圖見(jiàn)圖6，回收率見(jiàn)表5。由圖6知，發(fā)酵酒基質(zhì)中的紐甜峰形對(duì)稱，基線分離度高。由表5知，發(fā)酵酒基質(zhì)加標(biāo)回收率在99.9%～105.8%;回收率相對(duì)偏差RSD=2.8%～3.4%?；厥章屎拖鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》。優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量發(fā)酵酒基質(zhì)中紐甜含量。

2.6.3 含乳飲料及植物蛋白飲料3水平加標(biāo)結(jié)果

含乳飲料加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖7，植物蛋白飲料加標(biāo)色譜圖見(jiàn)圖8。含乳飲料及植物蛋白飲料回收率見(jiàn)表6。由圖7知，含乳飲料基質(zhì)中的紐甜峰形對(duì)稱，基線分離度高。由圖8知，植物蛋白飲料基質(zhì)中的紐甜峰形對(duì)稱，基線分離度高。由表6知，含乳飲料基質(zhì)加標(biāo)回收率在100.3%～104.4%;回收率相對(duì)偏差RSD=2.6%～3.7%。植物蛋白飲料基質(zhì)加標(biāo)回收在98.8%～108.1%;回收率相對(duì)偏差在2.5%～4.5%。含乳飲料和植物蛋白飲料回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均符合GB/T 27404-2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》。優(yōu)化后的方法能夠準(zhǔn)確定量含乳飲料基質(zhì)和植物蛋白飲料基質(zhì)中紐甜含量。

3 結(jié)論

紐甜在飲料基質(zhì)中穩(wěn)定性良好，且由于其甜度高、安全性好、不會(huì)造成齲齒等優(yōu)異特性，使其在飲料中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛[11]。為增強(qiáng)檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性、提高檢測(cè)效率及降低檢測(cè)成本，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)4種有代表性的飲料類樣品和發(fā)酵酒類樣品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，此方法在0.206～103.0μg·mL-1范圍內(nèi)線性良好。精密度實(shí)驗(yàn)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD=0.38%。通過(guò)對(duì)試驗(yàn)樣品基質(zhì)進(jìn)行3水平6平行的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)得出，其在1.03 mg·L-1水平加標(biāo)回收率在101%～104.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1%～3.8%;10.3 mg·L-1水平加標(biāo)回收率在102.1%～108.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.9%～4.5%;103 mg·L-1水平（飲料類限量）加標(biāo)回收率在98.7%～100.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～2.9%。優(yōu)化后的樣品前處理及液相梯度洗脫條件能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)飲料類樣品和發(fā)酵酒類樣品的準(zhǔn)確定量。

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