蔡燕斌 丁萍 劉月紅

摘 要：目的：建立了一種固相萃取-高效液相色譜法快速測(cè)定飲料中的堿性橙2（chrysoidine G，CDG）、堿性橙21（orange G，AOG）和堿性橙22（astrazon orange R，AOR）共3種禁用色素添加劑的方法。方法：樣品采用C18-SPE小柱凈化，洗脫液在35 ℃下用氮?dú)獯抵两珊笥枚ㄈ菀喝芙獠⒍ㄈ荩^(guò)有機(jī)相濾膜后在Agilent XDB C18色譜柱上，以20 mmol·L-1的乙酸銨溶液和甲醇（體積比為35∶65）作為流動(dòng)相進(jìn)行分離，采用二極管陣列檢測(cè)器（DAD）在449 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)CDG，在485 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)AOG及AOR，以外標(biāo)峰面積法定量。結(jié)果3種堿性橙染料在0.50～20.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好，方法回收率為86.8%～96.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于2%（n=6），方法的檢出限為0.01 mg·kg-1。結(jié)論：本方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，可適用于美年達(dá)和芬達(dá)等橙色飲料中堿性橙的檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜法;固相萃取;堿性橙染料;飲料

Abstract：Objective： To establish a SPE HPLC method for the rapid determination of three banned pigment additives in beverages， namelychrysoidine G （CDG） astrazon orange G （AOG）and astrazon orange R （AOR）. Methods： Samples were purified by C18-SPE small column， the eluate was blown to near dry with nitrogen at 35 ℃， dissolved and fixed volume with fixed volume solution， filtered by organic phase membrane， separated on Agilent XDB-C18 column with 20 mmol·L-1 ammonium acetate solution and methanol （volume ratio 35∶65） as mobile phase， and diode array detector was used for the determination of CDG at 449 nm and AOG and AOR at 485 nm with external standard method for quantification. Results： the linear relationship of the three basic orange dyes was good in the concentration range of 0.50～20.0 mg·L-1. The average recoveries were 86.8%～96.5% and the relative standard deviations were less than 2% （n=6）. The detection limits of the method were 0.01 mg·kg-1. Conclusion： The method is simple， rapid and accurate， and can be used for the determination of basic orange in orange drinks such as Mirinda， and Fanta.

Key words：High performance liquid chromatography; Solid phase extraction; Basic orange dye; Beverage

堿性橙染料是一類堿性工業(yè)染料，主要用于紡織品、木制品及皮革制品的染色，根據(jù)《中華人民共和國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》的相關(guān)規(guī)定，堿性橙染料是禁止用作食品添加劑的化學(xué)制品。由于堿性橙染料比檸檬黃、日落黃等水溶性染料更易上色且不易褪色，因此一些不法商販將堿性橙染料用于黃魚、辣椒、飲料和腐竹等豆制品的染色，以次充好，嚴(yán)重危害消費(fèi)者的身體健康。

食品中禁用的堿性橙染料主要有3種，包括堿性橙2（CDG）、堿性橙21（AOG）及堿性橙22（AOR）。目前主要有高效液相色譜法（HPLC）[1]、反相高效液相色譜法（RP-HPLC）[2]和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[3]等檢測(cè)方法。食品檢測(cè)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)主要是GB/T 23496-2009《食品中禁用物質(zhì)的檢測(cè) 堿性橙染料 高效液相色譜法》[4]，該方法中對(duì)于飲料等液體樣品的前處理方法操作時(shí)間長(zhǎng)、過(guò)程易損失，堿性橙染料回收率不好。本研究主要針對(duì)橙色飲料美年達(dá)、芬達(dá)和統(tǒng)一鮮橙多3種基質(zhì)，采用固相萃取的前處理方法，用高效液相色譜法進(jìn)行分離檢測(cè)，建立一套簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確的測(cè)定食品中堿性橙含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

美年達(dá)和芬達(dá)等液體樣品均購(gòu)自本地超市和市場(chǎng)。

1.2 儀器與試劑

甲醇、乙醇（色譜純，上海安譜公司）;乙酸銨（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）;標(biāo)準(zhǔn)品堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22（純度>88%，上海安譜公司）。所用試劑均為色譜純，試驗(yàn)用水為一級(jí)水。Agilent1260高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）;氮吹儀（美國(guó)ORGANOMATION ASSOCIATES INC.）;固相萃取儀（美國(guó)Agela Technologies）;渦旋混合器（德國(guó)IKA）;電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 混合標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制

①1 000 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。準(zhǔn)確稱取堿性橙2、堿性橙21和堿性橙22各約10 mg（按純度折算為100%），用甲醇溶解并定容至10 mL。②100 mg·L-1混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。取混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液1.0 mL，用定容液定容至10 mL。③混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作溶液。將混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液用定容液逐級(jí)稀釋，配制成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg·L-1和 20.0 mg·L-1的混合標(biāo)準(zhǔn)系列工作液，現(xiàn)用現(xiàn)配。定容液為65%體積的甲醇和35%體積的0.02 mol·L-1乙酸銨溶液的混合溶液。

1.3.2 儀器工作條件

Agilent XDB C-18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流動(dòng)相：A：0.02 mol·L-1乙酸銨溶液;B：甲醇;等梯度洗脫條件：A，35%;B，65%。流速：1.0 mL·min-1;柱溫：40 ℃;檢測(cè)波長(zhǎng)：堿性橙2：449 nm;堿性橙21、堿性橙22：485 nm。進(jìn)樣量：20 μL。檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器（DAD）。

1.3.3 試驗(yàn)方法

將飲料樣品混勻，稱取10 g（準(zhǔn)確至0.01 g）樣品，過(guò)Cleanert S C18-SPE固相萃取柱（2 g/12 mL），棄去流出液，最后抽干，再加10 mL無(wú)水乙醇洗脫固相萃取柱，控制2滴/s的下滴速度，收集全部洗脫液至試管中，最后抽干小柱，在35 ℃下用氮?dú)鈱⑾疵撘捍抵两?，加?.0 mL定容液，渦旋30 s溶解殘留物，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，收集濾液于進(jìn)樣瓶中以備進(jìn)樣。按色譜峰的保留時(shí)間定性，以峰面積外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 洗脫液類型和體積的選擇

分別采用10 mL乙醇、10 mL定容液、5 mL乙醇+5 mL定容液作為洗脫液，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)由于定容液中有35%的水，所以10 mL乙醇氮吹干得最快，5 mL乙醇+5 mL定容液次之，10 mL定容液最慢，在液相上檢測(cè)時(shí)用10 mL乙醇作為洗脫液3種堿性橙回收率最高，故用10 mL乙醇作為洗脫液。洗脫液乙醇體積分別為5、10、15 mL和20 mL時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果見表1，結(jié)果表明，采用5 mL乙醇洗脫回收率不高，10 mL乙醇洗脫回收率較好，用15 mL乙醇和20 mL乙醇洗脫回收率與10 mL乙醇差不多，但因氮吹時(shí)間太長(zhǎng)，故選用10 mL乙醇洗脫最佳。

2.2 氮吹溫度的選擇

分別選用20、30、35、40 ℃和50 ℃作為氮吹溫度，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)在20 ℃時(shí)氮吹時(shí)間較長(zhǎng)，3種堿性橙回收率極不穩(wěn)定，在40 ℃和50 ℃堿性橙2受溫度的影響較大，在35 ℃時(shí)3種堿性橙回收率最高，試驗(yàn)結(jié)果見表2。故選用35 ℃作為氮吹溫度。

2.3 最終定容溶液類型的選擇

分別用1.0 mL甲醇和1.0 mL定容液作為最終定容溶液，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)，用1.0 mL定容液作為最終定容溶液，在液相中檢測(cè)時(shí)3種堿性橙峰型較窄較好，峰高較高，用1.0 mL甲醇時(shí)峰型較寬較差，故選用1.0 mL定容液作為最終定容溶液。

2.4 樣品調(diào)PH值的選擇

芬達(dá)橙味碳酸飲料PH值在4左右，用稀氨水調(diào)節(jié)PH值至7左右，進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，樣品pH值在4左右時(shí)3種堿性橙2、21、22的回收率分別為89.5%、96.2%、94.5%，pH值在7左右時(shí)堿性橙2、21、22的回收率分別為88.7%、73.3%、68.8%，故樣品采用不調(diào)PH值直接檢測(cè)。

2.5 干擾試驗(yàn)

在色譜條件下，食品中常見的食用色素檸檬黃、日落黃、亮藍(lán)、胭脂紅、誘惑紅和添加劑苯甲酸、山梨酸、糖精鈉、咖啡因在449、485 nm處幾乎無(wú)吸收，均不會(huì)干擾堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22的測(cè)定。

2.6 線性關(guān)系及檢出限

對(duì)堿性橙2、堿性橙21、堿性橙22等3種堿性橙混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列進(jìn)行測(cè)定，在0.5～20.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)峰面積與溶液濃度之間呈一定的線性關(guān)系，以信噪比為3（S/N=3）計(jì)算檢出限，結(jié)果見表3。

2.7 回收率實(shí)驗(yàn)

按照試驗(yàn)方法對(duì)基底濃度分別為0的美年達(dá)和芬達(dá)分別進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見表4。

3 結(jié)論

本研究采用固相萃取-高效液相色譜法對(duì)美年達(dá)和芬達(dá)2種飲料樣品測(cè)定違禁添加色素堿性橙的含量，3種堿性橙染料在0.5～20.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，方法回收率為86.8%～96.5%。該方法可適用于美年達(dá)和芬達(dá)等飲料樣品中堿性橙染料的檢測(cè)，同時(shí)具有操作過(guò)程簡(jiǎn)單、快速、穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)：

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