李士杰, 楊 洋, 崔營營, 蘇賢斌

(南京工業(yè)大學(xué)化工學(xué)院, 南京 210009)

多肽作為治療藥物備受關(guān)注, 其主要的化學(xué)合成方法有固相合成法和液相合成法. 固相合成法雖然操作簡單、后處理方便, 但非均相合成不僅需要昂貴的樹脂、過量氨基酸和偶聯(lián)試劑, 還耗費(fèi)大量的溶劑和脫保護(hù)試劑[1,2]. 有害試劑和溶劑的大量使用使多肽合成的發(fā)展面臨巨大的挑戰(zhàn)[3]. 與固相合成法相比, 多肽液相合成法具有氨基酸及溶劑用量少且溶劑更加綠色等優(yōu)勢[4～7]. Sakakibara[8]提出在液相中使用1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)作為縮合試劑, 與1-羥基苯并三唑(HOBt)共同使用完成氨基酸的偶聯(lián), 通過水洗可以除去多余的縮合試劑. 這種方法使液相合成多肽更具有綠色化學(xué)的潛力, 合成成本的降低使其更具有市場競爭力[9,10].

近年來, 連續(xù)流動(dòng)化學(xué)在材料及藥物合成領(lǐng)域取得了巨大進(jìn)展[11～15], 在多肽化學(xué)合成中的應(yīng)用也受到了廣泛關(guān)注[16,17]. 雖然連續(xù)流動(dòng)化學(xué)在多肽固相合成上的應(yīng)用研究更加廣泛[18～21], 但其合成仍然需要使用昂貴的樹脂、管制化學(xué)品哌啶和大量的溶劑[22], 這與當(dāng)今社會(huì)追求的綠色化學(xué)相違背. 近年來, 有關(guān)連續(xù)流動(dòng)液相多肽合成的研究也有所發(fā)展[23,24]. Fuse等[25]采用T型混合器, 將羧基通過三光氣活化后, 利用注射泵連續(xù)流動(dòng)合成多肽. 雖然基于三光氣預(yù)活化的液相連續(xù)流動(dòng)并不適用于酸敏感的氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基, 具有很大局限性, 但均相反應(yīng)更加高效且溶劑的選擇更加多樣. 此外, 多肽合成選擇使用N端芐氧羰基Cbz保護(hù)的氨基酸, 通常采用鈀碳加氫的方式對(duì)Cbz進(jìn)行氫解脫除. 加氫反應(yīng)是有機(jī)合成中一種常見的反應(yīng)類型, 而連續(xù)流動(dòng)加氫法為非均相催化加氫反應(yīng)提供了更高的傳質(zhì)性能[26～29], 催化劑的回收利用與產(chǎn)物的純化也更方便, 能極大地提高生產(chǎn)效率. 與傳統(tǒng)釜式加氫法相比, 流動(dòng)加氫法在安全、效率和成本上更具優(yōu)勢.

亮丙瑞林(Leuprorelin, 序列為H-Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-D-Leu-Leu-Arg-Pro-NHEt)是天然促性腺激素釋放激素(GnRH)的合成類似物, 最早由日本武田公司研發(fā)生產(chǎn), 臨床上主要用于治療前列腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥[30], 對(duì)肯尼迪病也有很好的療效[31]. 1975年, Masahiko等[32]首次采用液相法合成了促黃體激素釋放激素的九肽酰胺類衍生物, 但其合成方法需要繁瑣的后處理, 且合成效率不高. Nicolas等[33]采用固相法合成亮丙瑞林, 最終用液體乙胺將肽鏈從樹脂上切割下來, 但需要在低溫、高壓密封條件下進(jìn)行, 反應(yīng)條件苛刻. 岑濤等[34,35]分別用微波輔助固相合成和液相片段縮合的方法合成了亮丙瑞林, 但固相合成最終也要從樹脂上切割下來后進(jìn)行乙胺化, 液相片段縮合處理繁瑣且片段需要固相合成.

本文將連續(xù)流動(dòng)法與多肽液相合成法相結(jié)合, 利用微通道反應(yīng)器傳質(zhì)傳熱效率高的特點(diǎn), 研究了在微通道反應(yīng)器中偶聯(lián)反應(yīng)溫度、濃度和停留時(shí)間等因素, 優(yōu)化了流動(dòng)反應(yīng)條件; 對(duì)比研究了微通道反應(yīng)器中水洗除雜效果, 利用鈀碳填料柱催化氫解脫除芐氧羰基保護(hù)基, 實(shí)現(xiàn)了更加高效綠色地合成亮丙瑞林.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

N-芐氧羰基-L-脯氨酸(Z-Pro-OH)、N5-二[(叔丁氧羰基)氨基]亞甲基-N2-(苯基甲氧基)羰基-L-鳥氨酸環(huán)己胺鹽[Z-Arg(Boc)2-OH·CHA]、N-芐氧羰基-L-亮氨酸二環(huán)己胺鹽(Z-Leu-OH·DCHA)、N-芐氧羰基-D-亮氨酸(Z-D-Leu-OH)、N-芐氧羰基-O-叔丁基-L-酪氨酸二環(huán)己胺鹽[Z-Tyr(tBu)-OH·DCHA]、N-芐氧羰基-O-叔丁基-L-絲氨酸[Z-Ser(tBu)-OH]、1-叔丁氧羰基-N-芐氧羰基-L-色氨酸二環(huán)己銨鹽[Z-Trp(Boc)-OH·DCHA]、N-芐氧羰基-N′-三苯甲基-L-組氨酸[Z-His(Trt)-OH]、N-芐氧羰基-L-焦谷氨酸[Z-Pyr-OH]、1-(3-二甲基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC·HCl)和1-羥基苯并三唑(HOBt)購自吉爾生化上海有限公司, 均為分析純; 三氟乙酸(TFA)和三異丙基硅烷(TIS)購自阿拉丁試劑上海有限公司, 均為分析純; 乙胺水溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)65%～70%)、乙酸乙酯(EA, 分析純)和碳酸鉀(分析純)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司; 高純氫氣購自南京特種氣體廠股份有限公司; 5%鈀碳催化劑(5% Pd/C, 質(zhì)量分?jǐn)?shù))購自陜西瑞科新材料股份有限公司. 其余試劑均為分析純.

DRX500 400MHz型和ADVANCEⅢ 600 MHz型核磁共振波譜儀(NMR, 德國Bruker公司); Agilent 1260分析型液相色譜儀(HPLC, 美國安捷倫公司); Agilent 6540型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用色譜儀(LC-MS, 美國安捷倫公司); RE-201D型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海東璽制冷儀器有限公司); X-4型顯微熔點(diǎn)儀(上海精密科學(xué)儀器有限公司); WZZ-1型自動(dòng)旋光儀(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司); MRCS100型微通道反應(yīng)器(山東金德新材料有限公司).

Scheme 1 Flow chart of continuous flow liquid phase synthesis of polypeptide

1.2 實(shí)驗(yàn)過程

Scheme 1為實(shí)驗(yàn)總流程示意圖. 將Cbz保護(hù)的氨基酸和偶聯(lián)試劑混合溶解后, 與C端片段一起泵入微通道反應(yīng)器中進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng), 偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后, 用K2CO3(質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%)水溶液在微通道反應(yīng)器中萃取分液除去偶聯(lián)試劑及多余的Cbz保護(hù)氨基酸; 有機(jī)相通過設(shè)計(jì)的鈀碳填料柱進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)氫解脫除Cbz保護(hù)基; 依次進(jìn)行偶聯(lián)-萃取分液-脫保護(hù)的過程, 最終實(shí)現(xiàn)多肽的連續(xù)流動(dòng)合成. 用HPLC跟蹤監(jiān)測整個(gè)反應(yīng)過程.

1.2.2 連續(xù)流動(dòng)脫除Cbz保護(hù)基的一般操作 將700 mLZ-Pro-NHEt的EA溶液(流速10 mL/min)和氫氣(壓力控制為0.55 MPa)同時(shí)通過鈀碳反應(yīng)柱(16 g, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的Pd/C, 柱管規(guī)格20 mm×250 mm), 設(shè)置反應(yīng)柱背壓為0.2 MPa, 脫除保護(hù)基后反應(yīng)液進(jìn)入收集瓶, 氣體從收集瓶上端導(dǎo)出; 反應(yīng)過程中用HPLC監(jiān)測至原料消失, 即得H-Pro-NHEt的EA溶液, 經(jīng)減壓蒸餾去除溶劑, 可獲得無色清油.

1.2.4 連續(xù)流動(dòng)合成全保護(hù)亮丙瑞林 重復(fù)以上脫保護(hù)和偶聯(lián)的一般操作步驟(Scheme 2). 在偶聯(lián)反應(yīng)中, 采取2股物料等流速進(jìn)料, 對(duì)脫保護(hù)后的另一股物料進(jìn)行體積定量, 通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去多余溶劑定容至700 mL, 不需蒸干溶劑, 確保以既定的物料比進(jìn)行下一步偶聯(lián)即可; 依次偶聯(lián)9.7 g(21.72 mmol)Z-Leu-OH·DCHA, 5.28 g(19.91 mmol)Z-D-Leu-OH, 11.0 g(19.91 mmol)Z-Tyr(tBu)-OH·DCHA, 5.88 g(19.91 mmol)Z-Ser(tBu)-OH, 12.3 g(19.91 mmol)Z-Trp(Boc)-OH·DCHA, 9.62 g(18.1 mmol)Z-His(Trt)-OH和4.76 g(18.1 mmol)Z-Pyr-OH; Cbz保護(hù)氨基酸的用量降低, 因?yàn)榉磻?yīng)過程已合成的多肽溶液會(huì)出現(xiàn)轉(zhuǎn)移損失, 避免氨基酸的過多剩余造成萃取除雜困難; 其中不含環(huán)己胺(CHA)及二環(huán)己胺(DCHA)的氨基酸不需要進(jìn)行酸洗除鹽操作, 直接配成溶液反應(yīng), 若出現(xiàn)溶解不充分現(xiàn)象, 可加入少量乙腈助溶; 合成完成后, 經(jīng)無水Na2SO4干燥, 減壓蒸餾得到帶保護(hù)的亮丙瑞林25.7 g, 產(chǎn)率76.1%, HPLC純度92.4%.

Scheme 2 Synthetic route of leuprorelin

Table 1 1H NMR and ESI-MS data for compounds 1—3 and 17—19*

*1H NMR conditions for compound1were 400 MHz and CDCl3, for compound3were 600 MHz and CDCl3, for compounds2and19were 600 MHz and DMSO-d6, respectively.

2 結(jié)果與討論

2.1 微通道反應(yīng)器偶聯(lián)條件的探索

2.1.1 溫度對(duì)偶聯(lián)轉(zhuǎn)化率的影響 將配制好的H-Pro-NHEt(0.02857 mmol/mL)和Z-Arg(Boc)2-OH(0.03428 mmol/mL)溶液通過輸液泵分別泵入微通道反應(yīng)器中; 設(shè)定2股物料的流速均為4 mL/min, 反應(yīng)停留時(shí)間10 min, 物料摩爾比為1∶1.2, 反應(yīng)溫度為30, 40, 50, 60和70 ℃時(shí)反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率分別是50.4%, 57.2%, 87.9%, 98.7%和100%. 可見, 加入2股物料后, 氨基酸偶聯(lián)的轉(zhuǎn)化率隨著溫度的升高而升高; 在70 ℃時(shí)可以實(shí)現(xiàn)完全轉(zhuǎn)化.

2.1.2 流速對(duì)偶聯(lián)轉(zhuǎn)化率的影響 設(shè)定反應(yīng)溫度為60 ℃, 物料摩爾比為1∶1.2, 設(shè)定流速參數(shù)分別為40, 20, 10, 8和4 mL/min; 在持液量80 mL恒定時(shí), 對(duì)應(yīng)的停留時(shí)間為1, 2, 4, 5和10 min, 轉(zhuǎn)化率分別為46.4%, 59.4%, 76.3%, 87.4%和98.7%. 可見, 在溫度與摩爾比一定時(shí), 隨著流速的增大相應(yīng)的停留時(shí)間減少, 偶聯(lián)轉(zhuǎn)化率降低.

2.1.3 反應(yīng)液濃度對(duì)偶聯(lián)轉(zhuǎn)化率的影響 設(shè)定反應(yīng)溫度為60 ℃, 流速4 mL/min, 在微通道反應(yīng)器中的停留時(shí)間為10 min; 配制氨基端氨基酸濃度分別為0.00714, 0.01428, 0.02857, 0.05714和0.11428 mmol/mL, 對(duì)應(yīng)羧基端氨基酸濃度分別為0.00857, 0.01714, 0.03428, 0.06857和0.13704 mmol/mL, 轉(zhuǎn)化率分別為98.2%, 98.7%, 98.7%, 98.5%和99.2%. 可見, 一定范圍內(nèi)濃度對(duì)偶聯(lián)反應(yīng)的影響不明顯, 當(dāng)氨基酸濃度過高時(shí), 有些Cbz保護(hù)氨基酸在EA中溶解過慢且容易析出. 因此, 選擇氨基端溶液濃度為0.02857 mmol/mL, 對(duì)應(yīng)的羧基端氨基酸溶液濃度為0.03428 mmol/mL進(jìn)行偶聯(lián)反應(yīng).

2.1.4 偶聯(lián)反應(yīng)溶劑的選擇 在連續(xù)液相合成多肽過程中, 采用萃取除雜的方式, 因而N,N-二甲基甲酰胺(DMF)等與水互溶的溶劑首先被排除. 難溶于水的常見溶劑中, 乙酸乙酯、氯仿和二甲基四氫呋喃優(yōu)良的溶解度能滿足偶聯(lián)反應(yīng)的需要, 而且沒有乳化現(xiàn)象, 能良好地萃取分層, 但乙酸乙酯相對(duì)于氯仿和二甲基四氫呋喃具有更加綠色和經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢.

基于上述實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析, 為保證偶聯(lián)反應(yīng)效率, 確定了亮丙瑞林連續(xù)流動(dòng)合成中微通道反應(yīng)器中偶聯(lián)反應(yīng)條件: 反應(yīng)溫度70 ℃, 流速4 mL/min即停留時(shí)間10 min, 反應(yīng)液濃度為0.02857 mmol/mL, 物料摩爾比為1.2, 該條件下偶聯(lián)轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到100%.

2.2 微通道反應(yīng)器中氨基酸的萃取效果

在液相多肽合成中, 萃取分液是重要的除雜步驟. 多肽偶聯(lián)反應(yīng)通常將N端Cbz保護(hù)氨基酸稍過量, 反應(yīng)后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的K2CO3水溶液萃取除去多余的Cbz保護(hù)氨基酸, 而且萃取洗滌可以將多余的EDC·HCl, HOBt及生成的EDU除去. 為了考察微通道反應(yīng)器與釜式反應(yīng)器中的萃取除雜效果, 表2對(duì)比了部分單個(gè)氨基酸在釜式和微通道反應(yīng)器中的萃取洗滌效率. 微通道反應(yīng)器中萃取條件是反應(yīng)液與5% K2CO3水溶液的體積比為1∶2, 反應(yīng)液流速2 mL/min, 5% K2CO3水溶液流速4 mL/min. 釜式反應(yīng)器中萃取洗滌采用機(jī)械攪拌的方式, 體積比與微通道反應(yīng)器的一致, 溫度均為30 ℃.

Table 2 Comparison of washing in the reaction caldron and washing in the microchannel

表2結(jié)果表明, 微通道反應(yīng)器的萃取除雜效果更優(yōu). 當(dāng)遇到Z-Tyr(tBu)-OH,Z-His(Trt)-OH,Z-Arg(Boc)2-OH和Z-Trp(Boc)-OH等難以萃取除去的氨基酸時(shí), 采取先脫除Cbz保護(hù)基再萃取的方式即可除去多余雜質(zhì).

2.3 連續(xù)流動(dòng)加氫脫Cbz保護(hù)

首先, 嘗試在微通道反應(yīng)器中催化加氫脫Cbz保護(hù), 將Pd/C與反應(yīng)液打成漿狀后, 一起進(jìn)料并一起出料. 利用Pd/C催化氫解脫保護(hù)是一個(gè)三相混合的反應(yīng), 在微通道反應(yīng)器中流速難以控制, 而且會(huì)出現(xiàn)堵塞, 反應(yīng)后需要過濾反應(yīng)液并反復(fù)清洗微通道反應(yīng)器. 因此, 選擇鈀碳填料柱連續(xù)流動(dòng)的方式進(jìn)行加氫脫保護(hù), 提高了加氫效率; 反應(yīng)后不需要過濾分離鈀碳, 通過有機(jī)溶劑對(duì)鈀碳柱進(jìn)行沖洗后, 鈀碳柱還可以重復(fù)利用, 提高了鈀碳的利用率.

已知在反應(yīng)釜中進(jìn)行加氫反應(yīng), 溫度為40 ℃, 氫氣壓力為1.0 MPa時(shí), 達(dá)到完全脫保護(hù)的時(shí)間在4 h以上; 在進(jìn)行連續(xù)流動(dòng)式柱加氫參數(shù)探索時(shí)發(fā)現(xiàn), 氫氣壓需要與流速達(dá)到一個(gè)平衡, 液體流速設(shè)定的同時(shí)調(diào)整氫氣的壓力, 隨著反應(yīng)液流速的增加, 所需平衡的氫氣壓力隨之增大; 為避免液體流入氣體管道形成液封, 最佳的連續(xù)流動(dòng)式加氫狀態(tài)是氣體與液體同時(shí)進(jìn)入收集罐; 實(shí)驗(yàn)設(shè)定反應(yīng)液流速5 mL/min時(shí), 對(duì)應(yīng)氫氣壓力0.3 MPa, 背壓0 MPa,Z-Pro-NHEt脫除Cbz效率為39.4%, 若增加背壓雖能提高轉(zhuǎn)化效果, 但氣液控制不穩(wěn)定; 設(shè)定反應(yīng)液流速10 mL/min時(shí), 對(duì)應(yīng)氫氣壓力0.55 MPa, 背壓0.2 MPa,Z-Pro-NHEt脫除Cbz效率為100%; 設(shè)定反應(yīng)液流速20 mL/min時(shí), 對(duì)應(yīng)氫氣壓力1.6 MPa, 背壓0.5 MPa,Z-Pro-NHEt脫除Cbz效率為76.2%; 最終選擇反應(yīng)液流速10 mL/min, 氫氣壓0.55 MPa, 背壓0.2 MPa, 對(duì)亮丙瑞林合成進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證, 結(jié)果列于表3, 反應(yīng)液于室溫下通過鈀碳柱3個(gè)循環(huán)基本可以將Cbz完全脫除.

Table 3 Continuous flow hydrogenation efficiency

Fig.1 HPLC and ESI-MS(inset) spectra for the synthesis of leuprorelina. Before washing with 5%(mass fraction) K2CO3; b. after washing with 5%(mass fraction) K2CO3; c. after deprotection by hydrogenolysis; d. solid-phase peptide synthesis; e. continuous flow liquid phase synthesis. Peak 1. HOBt; peak 2. ethyl acetate; peak 3. toluene; peak 4. Z-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Boc)2-Pro-NHEt; peak 5. H-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tBu)-Tyr(tBu)-D-Leu-Leu-Arg(Boc)2-Pro-NHE; peak 6. crude peptide of leuprorelin.

2.4 亮丙瑞林的合成及與固相合成對(duì)比

通過微通道反應(yīng)器的偶聯(lián)-萃取和鈀碳填料柱的連續(xù)流動(dòng)加氫反應(yīng), 最終完成了全保護(hù)亮丙瑞林的合成, 圖1(A)給出其對(duì)應(yīng)的譜圖分析. 與固相合成相比, 連續(xù)流動(dòng)液相合成的亮丙瑞林粗肽的純度更高且雜質(zhì)更少, 更有利于后續(xù)制備純化[圖1(B)]. 與固相合成相比, 連續(xù)流動(dòng)液相合成不僅可獲得更優(yōu)的亮丙瑞林粗肽, 而且在試劑用量、溶劑選擇及反應(yīng)效率等方面更具有優(yōu)勢: (1) 不使用昂貴的樹脂, 使用分子量更小的Cbz保護(hù)基, 提高了化學(xué)經(jīng)濟(jì)效益; (2) 不使用管制化學(xué)品哌啶, 利用鈀碳填料柱流動(dòng)式氫解脫保護(hù), 降低堿性環(huán)境消旋風(fēng)險(xiǎn)且催化劑可以重復(fù)使用; (3) 選用低毒溶劑EA代替第二類溶劑DMF且用量大大減少, 采用水洗萃取除雜, 反應(yīng)更加綠色; (4) 利用HPLC監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程更加客觀精確; (5) 利用微通道連續(xù)流提高了傳質(zhì)傳熱效率, 偶聯(lián)和萃取效率更佳; (6) 采用連續(xù)流動(dòng)鈀碳填料柱加氫脫Cbz保護(hù)基, 提高了加氫效率, 操作更加安全、方便.

3 結(jié) 論

采用微通道連續(xù)流反應(yīng)器和鈀碳填料柱加氫反應(yīng)裝置連續(xù)流動(dòng)液相合成亮丙瑞林. 考察了連續(xù)流動(dòng)偶聯(lián)反應(yīng)的溫度、停留時(shí)間和濃度對(duì)偶聯(lián)效率的影響, 確定最佳反應(yīng)溫度為70 ℃, 濃度為0.02857 mmol/mL, 反應(yīng)停留時(shí)間為10 min, 轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%. 利用微通道反應(yīng)器對(duì)反應(yīng)液萃取除雜, 采用萃取水洗溫度為70 ℃, 反應(yīng)液流速為2 mL/min, 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的K2CO3水溶液流速為4 mL/min. 設(shè)計(jì)連續(xù)流動(dòng)式鈀碳填料柱加氫裝置脫除芐氧羰基(Cbz)保護(hù)基, 通過調(diào)整反應(yīng)液流速和氫氣壓力達(dá)到穩(wěn)定的平衡條件, 確定氫氣壓力0.55 MPa, 流速10 mL/min, 背壓0.2 MPa. 與傳統(tǒng)多肽合成相比, 本文方法提高了合成效率, 極大地縮短了偶聯(lián)時(shí)間, 提高了萃取除雜效果. 連續(xù)流動(dòng)液相多肽合成是對(duì)傳統(tǒng)液相合成工藝的創(chuàng)新和突破, 提高了反應(yīng)效率, 降低了生產(chǎn)成本, 反應(yīng)更加安全、高效、綠色.