郝俊海， 吳敏， 駱新蘭， 陳婉雯， 梁遠(yuǎn)鋒， 林展翼

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 (廣東廣州 510280)； 廣東省人民醫(yī)院(廣東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院) 2心血管外科， 3病理醫(yī)學(xué)部， 4心血管內(nèi)科, 5老年醫(yī)學(xué)科(廣東廣州 510080)

特發(fā)性擴(kuò)張型心肌病(idiopathic dilated cardiomyopathy, IDCM)是一種原因未明、以心室擴(kuò)大及收縮功能減退且進(jìn)行性加重的原發(fā)性心肌病。根據(jù)WHO診斷標(biāo)準(zhǔn)，診斷IDCM需先行冠狀動(dòng)脈(下簡(jiǎn)稱“冠脈”)血管造影檢查排除嚴(yán)重冠脈狹窄(管腔狹窄程度≥50%)[1-2]。研究顯示明確診斷IDCM患者中存在血管造影與病理檢查不一致的情況[3-5]。Repetto等[6]對(duì)55例行心臟移植術(shù)的IDCM患者冠脈樹(shù)進(jìn)行病理檢測(cè)，結(jié)果顯示1/4的患者存在嚴(yán)重冠脈粥樣硬化，可能進(jìn)一步加重心功能障礙。而冠脈粥樣硬化是一種常見(jiàn)的具有增齡性改變的慢性炎癥疾病，兒童時(shí)期即可以出現(xiàn)血管相應(yīng)的病理改變，并隨著年齡的增長(zhǎng)而加重。由于冠脈標(biāo)本獲取困難，冠脈粥樣硬化的病理研究特別是初期輕微病變的研究較為緩慢。美國(guó)心臟協(xié)會(huì)于1992年將由平滑肌細(xì)胞(smooth muscle cells, SMCs)、彈性蛋白和蛋白多糖形成的、無(wú)脂質(zhì)或巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的肌彈性內(nèi)膜增厚(musculoelastic intimal thickening)定義為彌漫性內(nèi)膜增厚(diffuse intimal thickening, DIT)[7]。而SMCs是參與DIT發(fā)生、進(jìn)展的主要細(xì)胞，通常表達(dá)Ki-67[8]、Bax[9]、TEM1[10]等一系列抗原表征細(xì)胞增殖、凋亡、表型轉(zhuǎn)換等特征。然而，IDCM患者合并冠脈DIT病變病理特征及SMCs的性質(zhì)和行為尚未完全揭示。本研究擬對(duì)IDCM患者冠脈DIT病變特點(diǎn)及SMCs在其中的作用進(jìn)行研究，以豐富對(duì)IDCM合并冠脈輕微病變的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇自2017年11月1日至2018年8月30日在我院行心臟移植術(shù)治療終末期IDCM的患者共18例，術(shù)前經(jīng)過(guò)患者(未成年患者經(jīng)監(jiān)護(hù)人)及家屬同意并簽署書(shū)面知情同意書(shū)后，在患者心臟移植術(shù)取下病心后提取冠脈。收集患者年齡、性別、病史資料、術(shù)前心臟彩超等資料?；颊叩幕厩闆r及臨床資料見(jiàn)表1。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 組織學(xué)染色及免疫組織化學(xué)染色 仔細(xì)解剖病心，提取冠脈樹(shù)，多聚甲醛固定后常規(guī)石蠟包埋，并進(jìn)行連續(xù)病理切片。按照流程分別對(duì)組織切片進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)、Masson三色(Masson-trichrome)及VERHOEFF′S VAN-GIESON(EVG)染色。制片完成后使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行進(jìn)一步分析。

為進(jìn)一步明確細(xì)胞性質(zhì)，對(duì)固定的冠脈標(biāo)本再次進(jìn)行石蠟切片，根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用抗CD163抗體、抗caldesmon抗體、抗smoothelin抗體、抗Ki-67抗體、抗Bax抗體、抗TEM1抗體進(jìn)行免疫組化染色，添加生物素標(biāo)記二抗，繼而使用DAB顯色，并用蘇木精復(fù)染。

表118例患者的基本信息和臨床資料

項(xiàng)目數(shù)據(jù)年齡(歲) 42.2±12.2年齡范圍(歲)12～55性別[例(%)] 男10(56.0) 女8(44.0)吸煙史[例(%)]2(11.1)嗜酒史[例(%)]0(0.0)心肌病家族史[例(%)]1(5.6)高脂血癥[例(%)]2(11.1)糖尿病[例(%)]0(0.0)高血壓[例(%)]0(0.0)其他血管疾病[例(%)]1(5.6)左房大小(mm)?53.8±10.8右房大小(mm)?58.6±11.5右室直徑(mm)?70.2±14.1左室收縮末期直徑(mm)?68.3±10.1左室舒張末期直徑(mm)?77.4±11.6左室射血分?jǐn)?shù)(%)?26.6±7.3

注：*為移植前最近一次心臟彩超數(shù)據(jù)

1.3 病變程度評(píng)估 采用內(nèi)膜厚度(intimal thickness)、內(nèi)膜-中膜厚度比(intima-media ratio, I/M)來(lái)定量評(píng)估DIT病變程度。選取HE染色，使用CCD照相系統(tǒng)分別在高倍鏡下(20×)拍攝切片，每張切片約拍攝4～6個(gè)部位，拍照后測(cè)定內(nèi)膜厚度、中膜厚度，并計(jì)算I/M。

2 結(jié)果

2.1 DIT的病理特征 18例患者的冠脈均存在不同程度的粥樣硬化病變，其中6例患者在冠脈樹(shù)病理切邊組織中尚可發(fā)現(xiàn)DIT病變，而其余11例患者切片組織中最輕的病變已經(jīng)為病理性內(nèi)膜增厚病變，1例患者的組織學(xué)改變已完全是粥樣硬化斑塊。對(duì)6例患者的病理染色進(jìn)行進(jìn)一步分析，組織學(xué)染色顯示DIT病變內(nèi)皮細(xì)胞層大體完整，內(nèi)膜呈局部增厚或局部嚴(yán)重的彌漫性增厚，即同一切片存在不同程度的DIT病變。EVG染色結(jié)果顯示，部分病變部位內(nèi)彈力層(internal elastic lamina, IEL)形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整，而另一部分病變部位IEL呈不同程度碎片化。根據(jù)IEL形態(tài)將DIT病變分為IEL完整組、IEL碎片化組，高倍鏡下HE染色顯示IEL完整組內(nèi)皮完整，內(nèi)膜較薄，中膜結(jié)構(gòu)完整，而IEL碎片化組內(nèi)皮細(xì)胞層粗糙，內(nèi)膜增厚、細(xì)胞數(shù)增多，內(nèi)中膜界限欠清晰，中膜內(nèi)層平滑肌細(xì)胞形態(tài)異常。而Masson染色顯示IEL碎片化組內(nèi)膜增厚，內(nèi)膜膠原含量(藍(lán)色顯示)增多。分別測(cè)定IEL完整組和IEL碎片組內(nèi)膜厚度為(70.1±6.5)μmvs(154.0±3.8)μm，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，內(nèi)膜-中膜厚度比為0.49±0.04vs0.98±0.09，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖1。

注：A：DIT病變HE染色，DIT病變內(nèi)皮細(xì)胞層大體完整，內(nèi)膜呈局部增厚或局部嚴(yán)重的彌漫性增厚，即同一切片存在不同程度的DIT病變；B：DIT病變EVG染色；C：IEL完整組EVG染色，內(nèi)彈力層(internal elastic lamina, IEL)形態(tài)規(guī)則、結(jié)構(gòu)完整；D：IEL碎片化組EVG染色，IEL呈不同程度碎片化；E：IEL完整組HE染色，F(xiàn)：IEL碎片化組HE染色，相比IEL完整組，IEL碎片化組內(nèi)皮細(xì)胞層粗糙，內(nèi)膜增厚、細(xì)胞數(shù)增多，內(nèi)中膜界限欠清晰，中膜內(nèi)層平滑肌細(xì)胞形態(tài)異常；I：IEL完整組與碎片化組內(nèi)膜厚度比較 *P<0.001；J：IEL完整組與碎片化組內(nèi)膜-中膜厚度比比較 *P<0.001

圖1彌漫性內(nèi)膜增厚(DIT)的病理特征

2.2 SMCs的增殖、凋亡與表型轉(zhuǎn)化 為明確細(xì)胞類型和細(xì)胞學(xué)行為，對(duì)6例患者的冠脈切片行免疫組化染色檢查。IEL正常組內(nèi)皮下層可見(jiàn)Caldesmon陽(yáng)性、smoothelin陰性細(xì)胞，內(nèi)膜可見(jiàn)Bax陰性細(xì)胞，同時(shí)，Ki-67、TEM1在內(nèi)膜、中膜均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)IEL碎片化組內(nèi)膜明顯增厚，其內(nèi)可見(jiàn)大量Caldesmon陽(yáng)性細(xì)胞，部分細(xì)胞同時(shí)呈smoothelin陽(yáng)性。碎片化組內(nèi)膜可見(jiàn)TEM1陽(yáng)性細(xì)胞，同時(shí)內(nèi)膜、中膜內(nèi)層Bax陰性細(xì)胞明顯增加。而Ki-67在內(nèi)膜、中膜均未見(jiàn)陽(yáng)性表達(dá)(圖2)。

3 討論

IEL是由彈性纖維形成的多孔致密柔性屏障，在冠脈中作為內(nèi)膜與中膜的分界線，其孔隙結(jié)構(gòu)可調(diào)節(jié)內(nèi)中膜間大分子物質(zhì)和細(xì)胞的交換[11]。IEL孔隙結(jié)構(gòu)增大可允許低密度脂蛋白等致粥樣硬化大分子物質(zhì)通過(guò)，影響粥樣硬化病變發(fā)生及發(fā)展[12-14]。根據(jù)EVG染色結(jié)果對(duì)DIT病變進(jìn)行分類，IEL完整組內(nèi)膜厚度、I/M、內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外膠原含量均較低，提示病變程度較輕。而IEL碎片化組內(nèi)膜厚度、I/M、內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞外膠原含量明顯提高，提示病變程度較嚴(yán)重。IEL完整性是影響內(nèi)、中膜物質(zhì)和細(xì)胞交換的重要因素，同時(shí)也顯示出與DIT病變程度的相關(guān)性，需要進(jìn)一步研究IEL在粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展中的作用。

SMCs是DIT病變的主要參與細(xì)胞，既往對(duì)其特性和作用分析較少。Caldesmon等可作為SMCs標(biāo)志物，而Smoothelin只在分化完全的收縮型SMCs中表達(dá)[15]，可用于表型鑒定。研究結(jié)果顯示，IEL完整組內(nèi)膜細(xì)胞主要為分泌型SMCs，而IEL碎片化組內(nèi)膜細(xì)胞明顯增多，包含了收縮型與分泌型SMCs。同時(shí)，IEL碎片化組出現(xiàn)較多TEM1陽(yáng)性細(xì)胞結(jié)果，這提示IEL碎片化組可能發(fā)生內(nèi)膜SMCs表型轉(zhuǎn)化。從染色結(jié)果看，IEL碎片化組內(nèi)膜與中膜內(nèi)層的SMCs細(xì)胞形態(tài)及抗原表達(dá)接近，提示可能發(fā)生了中膜SMCs向內(nèi)遷移，這一點(diǎn)需要細(xì)胞示蹤實(shí)驗(yàn)證實(shí)。進(jìn)一步分析，分泌型SMCs富含粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，細(xì)胞代謝活躍，具有更高的能量需求[16-17]，這可能是SMCs來(lái)源泡沫細(xì)胞形成的一個(gè)重要因素。動(dòng)脈粥樣硬化是一種發(fā)展非常緩慢的疾病，DIT是這一過(guò)程最早的階段，因此平滑肌細(xì)胞增殖率很低，無(wú)法檢測(cè)出Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞，這一結(jié)果與Nakagawa等[18]一致?？笲ax染色提示，IEL碎片化組內(nèi)膜Bax陰性細(xì)胞較正常組明顯增加，提示發(fā)生了細(xì)胞凋亡減少，這可能是DIT內(nèi)膜平滑肌細(xì)胞數(shù)量增加及病變進(jìn)展的原因。

注：A：IEL完整組抗Caldesmon染色；B：IEL碎片化組抗Caldesmon染色；C：IEL完整組抗Smoothelin染色；D：IEL碎片化組抗Smoothelin染色；E：IEL完整組抗Ki-67染色；F：IEL碎片化組抗Ki-67染色；G：IEL完整組抗Bax染色；H：IEL碎片化組抗Bax染色；I：IEL完整組抗TEM1染色；J：IEL碎片化組抗TEM1染色

圖2SMCs的增殖、凋亡與表型轉(zhuǎn)化

綜上所述，冠脈粥樣硬化在終末期IDCM患者中普遍存在。IEL完整性、SMCs表型轉(zhuǎn)化及凋亡降低可能是引起DIT病變進(jìn)展的重要因素。作為容易被忽視的合并癥，IDCM合并冠脈粥樣硬化需更進(jìn)一步的研究。