謝志娟, 陳建英

1南華大學附屬第一醫(yī)院腎內科(湖南衡陽 421001)； 2湖南省人民醫(yī)院風濕免疫科(湖南長沙 410005)

失血性休克復蘇后、腎移植術及腎部分切除術后不僅可引起腎臟缺血再灌注損傷，而且誘導氧化應激(ROS)反應，同時沉默信息調節(jié)因子(silent mating type information regulator, SIRT)、炎癥及未折疊蛋白反應等信號通路促進腎上皮細胞過度凋亡[1-3]。我們前期研究證實[4]，內質網未折疊蛋白反應-凋亡途徑介導一系列生物學效應促進轉化生長因子β1(transforming growth factor-β1, TGF-β1)誘導肺上皮細胞損傷。馬懿等[5]發(fā)現(xiàn),沉默信息調節(jié)因子1(recombinant sirtuin 1, SIRT1) 激動劑白藜蘆醇苷上調SIRT1介導單核細胞趨化蛋白1(monocytes chemotactic protein-1, MCP-1)抑制氧化型低密度脂蛋白(oxidation low lipoprotein, ox-LDL)誘導巨噬細胞增殖、細胞氧化應激及炎性反應從而保護血管內皮細胞。而且我們前期研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇苷可通過介導TGF-β1/miR-21信號通路抑制足細胞增殖及NLRP3炎性小體活化的表達從而保護足細胞損傷，但是尚未探究白藜蘆醇苷上調SIRT1是否介導未折疊蛋白反應-凋亡途徑保護腎缺血再灌注損傷的具體分子機制[6]。本研究旨在探討白藜蘆醇苷介導SIRT1是否抑制未折疊蛋白反應-凋亡途徑在腎缺血再灌注損傷中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、實驗動物、試劑及藥品 雄性SD大鼠32只，體重380～420 g，由南華大學動物實驗部提供。冷凍高速離心機及臺式冷凍離心機(德國公司生產)，超凈工作臺(蘇信凈化設備廠)，白藜蘆醇苷(純度約99%)購自西安天一生物技術有限公司，DMEM培養(yǎng)液(Sigma-Aldrich,USA)，胎牛血清(20%FBS,Gibco,USA)，超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)檢測試劑盒、二辛可寧酸(BCA)法蛋白質定量試劑盒(Sigma,USA)，白細胞介素-1β(IL-1β)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒，SIRT1、X盒結合蛋白1 (X-box-binding protein 1, XBP1s)、轉錄激活子4(activating transcription factor 4, ATF4)及半胱天冬蛋白酶-3(caspase-3)等兔多克隆抗體(Santa Cruz,USA)，2′,7′-二氯二氫熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)(Sigma,USA)，TUNEL檢測試劑盒(Roche公司，美國)。

1.2 模型制備及處置 適應性喂養(yǎng)7 d后，營養(yǎng)狀態(tài)良好，按照隨機原則分為假手術組(A組)、腎缺血再灌注組(B組)、白藜蘆醇苷組(C組)、SIRT1抑制劑EX-527組(D組)，每組8只。實驗前12 h禁食禁水。經腹腔注射1%氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，備皮消毒后行正中剖腹手術。B組大鼠暴露腎臟，雙側腎蒂組織鈍性分離并予以夾閉，腎臟由鮮紅變?yōu)樽仙崾咀钄喑晒ΑＨ毖獣r間持續(xù)0.5 h后行再灌注，腎臟顏色又恢復到鮮紅表明再灌注成功。C組術前45 min予以白藜蘆醇苷10 mg/(kg·d)尾靜脈注射。D組術前45 min予以SIRT1抑制劑(EX-527)5 mg/(kg·d)尾靜脈注射。24 h后處死大鼠并收集腎臟標本及血清。本研究通過南華大學附屬第一醫(yī)院倫理委員會批準，動物處置方法依據(jù)動物倫理學標準。

1.3 方法

1.3.1 生化檢查方法 采用硫代巴比妥酸法檢測血清MDA及WST-1法檢測SOD；采用DCFH-DA負載法檢測腎細胞活性氧(reactive oxygen species, ROS)水平；采用ELISA法檢測IL-1β及TNF-α水平；采用全自動生化分析儀(日本日立公司)檢測血清肌酐(Cr)和血清尿素氮(BUN)濃度。以上嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.2 凋亡檢查方法 采用TUNEL試劑盒檢測細胞凋亡情況，以上嚴格按試劑盒說明書操作。

1.3.3 Western blot檢測腎組織SIRT1、XBP1s、ATF4及caspase-3蛋白的表達 充分裂解腎組織提取蛋白并采用BCA法測蛋白濃度，提取等量蛋白質進行電泳(SDS-PAGE)，采用硝酸纖維素(PVDF)電轉膜；5%脫脂牛奶封閉1 h后，分別加入SIRT1、XBP1s、ATF4及caspase-3一抗4℃孵育過夜，α-Tubulin作為內參；次日用磷酸鹽緩沖液洗膜，加入二抗室溫孵育1 h。然后用顯色(化學發(fā)光法)，采集圖像(UVP型凝膠圖像分析系統(tǒng))，分析條帶積分吸光度(Image J 軟件)，以A組為參照計算蛋白的表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 23.0統(tǒng)計軟件建立數(shù)據(jù)文件，計量正態(tài)分布數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，多組與對照組比較采用Dunnett-t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠氧化應激指標、腎功能及細胞凋亡指數(shù)的比較 與A組比較，B組血清Cr、BUN、MDA、ROS含量和細胞凋亡指數(shù)明顯升高，SOD含量明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與B組比較，C組血清Cr、BUN、MDA、ROS含量和細胞凋亡指數(shù)明顯降低，SOD含量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而D組通過下調SIRT1后各項指標變化與C組比較呈相反的趨勢(P<0.05)。見表1。

表1各組中MDA、SOD、ROS、Cr、BUN及細胞凋亡指數(shù)水平的比較

組別MDASODROSBUNCr細胞凋亡指數(shù)(nmol/mg)(u/mg)(AU)(mmol/mg)(μmol/L)(%)A組7.26±2.1725.11±5.521.06±0.02 12.36±1.9241.11±10.149.96±2.13B組16.26±3.37?10.22±2.13?2.16±0.05?26.30±3.15?126.27±26.87?43.22±4.77?C組9.26±2.91△20.76±4.87△1.51±0.04△16.41±6.67△83.31±8.09△32.37±5.39△D組24.41±3.67△15.56±2.42△3.45±0.06△35.26±3.37△189.54±28.10△54.80±5.09△

注：*與A組比較P<0.05; △與B組比較P<0.05

2.2 各組大鼠SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達及炎癥指標的比較 與A組比較，B組腎組織SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達和IL-1β、TNF-α水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與B組比較，C組腎組織SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達和血清IL-1β、TNF-α水平明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而D組通過下調SIRT1后各項指標變化與C組比較呈相反的趨勢(P<0.05)。見圖1、表2。

表2各組中SIRT1、XBP1s、ATF4、caspase-3蛋白表達及血清IL-1β、TNF-α的比較

組別SIRT1(%)XBP1s(%)ATF4(%)caspase-3IL-1β(pg/mL)TNF-α(pg/mL)A組1.01±0.011.02±0.021.06±0.02 1.06±0.0151.11±12.23114.96±24.13B組2.26±0.33?2.11±0.25?2.61±0.27?2.03±0.59?83.77±10.24?162.32±43.22?C組1.66±0.31△1.71±0.41△1.44±0.34△1.41±0.37△51.79±14.05△116.21±17.25△D組3.13±0.40△2.72±0.28△3.32±0.31△2.42±0.63△90.23±11.01△188.93±44.14△

注：*與A組比較P<0.05; △與B組比較P<0.05

圖1 Western blot檢測SIRT1、XBP1s、ATF4及caspase-3蛋白表達

3 討論

本課題組前期通過阻斷腎血管0.5 h后再灌注的方法構建腎缺血再灌注損傷模型實驗結果顯示，腎組織病理學損傷明顯加重及血清Cr、BUN等指標明顯升高提示大鼠腎缺血再灌注損傷模型構建成功[7]。此次研究結果還發(fā)現(xiàn)，大鼠腎缺血再灌注后血清Cr、BUN及細胞凋亡指數(shù)明顯升高提示與前期研究工作一致[6]。我們前期研究也發(fā)現(xiàn)[8-9]，過氧化與抗氧化之間的調控失衡誘導氧自由基的爆發(fā)性釋放和氧自由基自我清除能力顯著下降，上述情況嚴重影響細胞膜的流動性和促進細胞過度脂質化，最后導致腸缺血再灌注后的細胞損傷。同時實驗進一步證實炎癥-凋亡途徑在腸缺血灌注損傷中扮演重要的角色。鑒于上述實驗基礎我們通過大鼠腎缺血再灌注損傷也發(fā)現(xiàn)，血清MDA、ROS、IL-1β、TNF-α的含量和腎組織caspase-3蛋白表達明顯升高，SOD含量明顯降低，提示ROS/炎癥/凋亡軸參與腎缺血再灌注損傷。與此同時，未折疊蛋白-凋亡信號途徑是否參與缺血再灌注損傷另外的一個新機制？Liu等[10]研究顯示，缺血再灌注損傷可介導氧化應激-未折疊蛋白反應途徑誘發(fā)錯誤或未折疊蛋白質蓄積。而Tang等[11]研究顯示持續(xù)或過度的未折疊蛋白反應的重要轉錄因子XBP1s及ATF4可介導caspase-3等信號途徑誘發(fā)細胞焦亡或死亡，從而導致組織損傷。我們研究結果顯示大鼠腎缺血再灌注損傷腎組織XBP1s及ATF4明顯升高提示未折疊蛋白信號通路參與其分子病理機制。

Liu等[12]研究報道：上調SIRT1通過調控NLRP3炎癥小體及NF-κB信號通路抑制機體內的炎癥反應及氧化應激反應，從而保護LPS誘導的小鼠急性肺損傷。Kang等[13]研究也報道，SIRT1與未折疊蛋白反應途徑相互作用調控B細胞氧化還原平衡與炎癥的分子機制。SIRT1激動劑白藜蘆醇苷是一種藥效學多樣化的多酚類化合物,具有調控內質網應激、凋亡、活性氧生成及炎性因子表達等生物效應[14-16]。并且本課題組前期研究表明，白藜蘆醇通過阻礙細胞周期進展及促進細胞凋亡途徑抑制人胚肺成纖維細胞細胞增殖[17]。因此，我們推測白藜蘆醇苷可能通過調控SIRT1蛋白對大鼠腎缺血再灌注損傷的上述的機制產生影響。為了論證此假說，本研究依照文獻經尾靜脈注射SIRT1激動劑和抑制劑后發(fā)現(xiàn)，SIRT1激動劑即白藜蘆醇苷10 mg/kg, 連續(xù)7 d干預后能有效抑制未折疊蛋白過度反應-凋亡途徑及氧化應激-炎癥反應途徑等分子信號途徑保護腎缺血再灌注損傷，然而SIRT1抑制劑即EX-527 5 mg/(kg·d), 連續(xù)7 d的預處理結果卻與之相反。

綜上所述，大鼠腎缺血再灌注損傷的病理生理機制與SIRT1介導的未折疊蛋白過度反應-凋亡及氧化應激-炎癥反應信號通路激活有關，而SIRT1激動劑白藜蘆醇苷通過抑制未折疊蛋白過度反應-凋亡及氧化應激-炎癥反應途徑發(fā)揮保護大鼠腎缺血再灌注損傷的作用。本研究僅通過體外研究模擬腎缺血再灌注損傷致病過程，我們下一步將進行體內實驗進一步探究其機制及藥物的靶向治療提供一定的理論依據(jù)。