黃曦瑤, 汪惠麗

(合肥工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,安徽 合肥 230601)

隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展,環(huán)境問題日益突出,危害著人類的身心健康。同時(shí),隨著生活水平的提高,人們開始追求生活質(zhì)量的更高標(biāo)準(zhǔn),致力于在日常的生活飲食中鞏固和改善自己的身體狀況。人體腸道內(nèi)生活著數(shù)百種、數(shù)十萬(wàn)億種不同的微生物需要依靠人體才能存活,但同時(shí)也與寄主的健康狀況息息相關(guān)。而益生菌作為一種有益菌對(duì)腸道菌群的穩(wěn)態(tài)以及身體起到了積極的作用,因此也漸漸意識(shí)到益生菌帶給人們的有益作用。

工業(yè)生產(chǎn)、金屬冶煉、化肥殺蟲劑的使用等使得鉛(Pb)、鎘(Cd)、砷(As)和汞(Hg)等重金屬?gòu)V泛地分布于環(huán)境中[1-4]。環(huán)境中的重金屬嚴(yán)重影響土壤的壽命以及水生和陸生生物的生命,同時(shí)環(huán)境中的重金屬可以在土壤中富集，繼而被植物吸收蓄積于體內(nèi)最終通過食物鏈進(jìn)入人體,從而損害機(jī)體健康[5-8]。其中鉛是一種多系統(tǒng)、多親和性的環(huán)境毒物,性質(zhì)穩(wěn)定且無安全劑量,可以影響包括神經(jīng)、造血和內(nèi)分泌等系統(tǒng)[9]。近年來,國(guó)內(nèi)外對(duì)鉛的神經(jīng)毒性的研究取得了一系列進(jìn)展,如干擾神經(jīng)遞質(zhì)的傳遞與神經(jīng)遞質(zhì)受體表達(dá),引起氧化應(yīng)激,加劇海馬、紋狀體等區(qū)域細(xì)胞的死亡。除此以外,有文獻(xiàn)表明社會(huì)行為也是毒理學(xué)的效應(yīng)表征之一,且早期重金屬錳的暴露可導(dǎo)致小鼠的順從行為[10-12]。鉛暴露的毒性機(jī)制如今已在細(xì)胞、基因表達(dá)、分子水平等多個(gè)方面展開積極性的探索,但鉛與大鼠社會(huì)行為的研究目前較少,考慮到鉛的毒性作用，本文探究早期鉛暴露對(duì)大鼠社會(huì)行為的影響。

社會(huì)生活使動(dòng)物易于獲得食物,增加自我繁殖,降低掠食風(fēng)險(xiǎn),但也會(huì)導(dǎo)致個(gè)體過度與關(guān)鍵資源競(jìng)爭(zhēng)[13-14]。同時(shí)激烈的攻擊行為也會(huì)讓個(gè)體花費(fèi)更多的時(shí)間和精力,更有可能吸引掠食者,因此為避免此類風(fēng)險(xiǎn),許多動(dòng)物進(jìn)化出明顯的等級(jí)制度以降低同種個(gè)體的攻擊行為，進(jìn)而形成穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)——從屬關(guān)系[14]。動(dòng)物社會(huì)等級(jí)因個(gè)體在種群內(nèi)的狀態(tài)及競(jìng)爭(zhēng)者而存在較大的差異,社群經(jīng)歷、生活環(huán)境等因素均可制約動(dòng)物的社會(huì)等級(jí)[15]。對(duì)于生命有機(jī)體來說,環(huán)境對(duì)動(dòng)物的發(fā)育具有一定的影響,尤其是早期生活環(huán)境受損可能會(huì)使動(dòng)物的大腦發(fā)育造成異常,進(jìn)而影響個(gè)體后續(xù)的發(fā)展。

腸道微生物與人體共生且互相適應(yīng),腸道微生物的變化或失調(diào)影響機(jī)體功能,與一些疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān),如腸道疾病、代謝性疾病、免疫性疾病、心血管疾病等,還能影響大腦發(fā)育和功能,如孤獨(dú)癥、阿爾茨海默病、帕金森綜合征等[16-17]。異常穩(wěn)態(tài)的機(jī)體可以通過重建體內(nèi)菌群的生態(tài)平衡來實(shí)現(xiàn)緩解和治療。有研究發(fā)現(xiàn)益生菌可以通過大腦以及中樞神經(jīng)對(duì)動(dòng)物的行為產(chǎn)生一定的影響,但具體的機(jī)制尚不明確。因此本文旨在建立社會(huì)優(yōu)勢(shì)行為的表征模型,研究早期鉛暴露對(duì)大鼠社會(huì)行為的影響,并探究腸道益生菌攝入是否能夠修復(fù)早期鉛暴露引起的機(jī)體損傷。

1 材料方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)所用的SD大鼠從安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心獲得,喂養(yǎng)在恒溫25 ℃,光照12 h,黑暗12 h的SPF級(jí)動(dòng)物房?jī)?nèi)。將發(fā)育期的母鼠設(shè)置為鉛組、鉛+益生菌組、益生菌組和空白對(duì)照組。所有的大鼠都能獲得同等標(biāo)準(zhǔn)的食物和水,子代大鼠在發(fā)育期通過母鼠獲取鉛(50 mg/L),斷奶之后通過飲水?dāng)z入鉛。益生菌通過單獨(dú)的容器給予(每只1010cfu/d),并保證大鼠在5 min內(nèi)取食完,待大鼠長(zhǎng)至成熟期(PND 90)時(shí)開始進(jìn)行動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)(每組10只雄鼠)。各組大鼠的平均體質(zhì)量為413.09 g(空白對(duì)照組);414.75 g(鉛組);422.40 g(鉛+益生菌組);413.57 g(益生菌組)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)器材及所用菌

透明籠子(50 cm×50 cm×50 cm),XR-XZ301自發(fā)活動(dòng)曠場(chǎng)分析系統(tǒng)(上海欣軟信息技術(shù)有限公司)。益生菌(生合生物科技有限公司),其中包括嗜酸乳桿菌(LA1063)、鼠李糖乳桿菌(LRH10)、副干酪乳桿菌(LPC12)、嗜熱鏈球菌(ST30)、瑞士乳桿菌(LH43)、發(fā)酵乳桿菌(LF26)、長(zhǎng)雙歧桿菌(BL986)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠編號(hào)

在大鼠幼年時(shí)使用不同的標(biāo)記物在其尾巴上做標(biāo)記,每組大鼠的編號(hào)為1～10。在大鼠90 d時(shí)進(jìn)行稱重記錄,后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行配對(duì),要求配對(duì)的2只大鼠體質(zhì)量之間的差異在10 g之內(nèi)。

1.2.2 公平條件下的社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

侵略行為是幾乎所有動(dòng)物的自然行為之一,從生物學(xué)的角度來看,攻擊性行為可以被視為旨在主動(dòng)控制社會(huì)環(huán)境的一種社交溝通方式。但是在與對(duì)手互動(dòng)中進(jìn)行的一系列典型性攻擊行為,如打擊侵略、身體沖突等不僅對(duì)受害者不利,而且對(duì)侵略者也有害。因此,動(dòng)物群體中也漸漸進(jìn)化出一種機(jī)制來最小化和控制身體攻擊,以防止其潛在的不利后果,如威脅行為。同樣的大鼠社會(huì)中,不同大鼠也常常為了爭(zhēng)奪領(lǐng)地、配偶等資源進(jìn)行一定的威脅行為和攻擊行為,用來宣誓主權(quán)。因此為了探究大鼠社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)行為展開以下實(shí)驗(yàn)。

籠子在使用前用酒精清洗消毒,然后將2只不同組別的大鼠放在籠子里,計(jì)時(shí)10 min,然后觀察10 min內(nèi)每只大鼠攻擊性行為發(fā)生的時(shí)間和次數(shù)(特征行為小于1 s的組別排除)。同時(shí)為了實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性,大鼠的社會(huì)探索行為也需要被一并考量,作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)中記錄大鼠的攻擊性行為包括站立、按壓、側(cè)面威脅、扭打、追逐;普通社會(huì)探索行為包括探索、聞氣味和梳毛等。

1.2.3 水剝奪實(shí)驗(yàn)

為了更好地反映各組大鼠的社會(huì)行為差異,將大鼠生活環(huán)境中的一個(gè)資源剝奪一段時(shí)間后,通常大鼠為了搶奪資源,會(huì)表現(xiàn)出更加強(qiáng)烈的攻擊行為和搶奪行為,以此來觀察和判斷其社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)力。取走大鼠籠子里的水源,至少斷水24 h,然后將2只不同組的大鼠放到有水源的透明立方體籠子里,該水源1次只能讓1只大鼠飲用。觀察并記錄每只大鼠在10 min內(nèi)喝水的次數(shù)和喝水的時(shí)間,其中每次搶水成功和搶水失敗的情況也要記錄。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,且每次實(shí)驗(yàn)配對(duì)的老鼠都是相同的,目的是讓大鼠形成穩(wěn)定的社會(huì)秩序,以此來觀察每只大鼠的社會(huì)資源競(jìng)爭(zhēng)力。

1.2.4 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)主要是觀察實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在全新環(huán)境中的自主探索行為、與神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)的焦慮度等,以及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在新奇環(huán)境之中某些行為的發(fā)生頻率和持續(xù)時(shí)間等,反應(yīng)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在陌生環(huán)境中的自主行為與探究行為。當(dāng)大鼠進(jìn)入到一個(gè)全新的、空曠的環(huán)境中,由于未知和緊張,一般會(huì)在環(huán)境的邊緣進(jìn)行探索,然后逐漸向中心靠攏。如果大鼠長(zhǎng)期在邊緣探索不向中間靠攏,那么表示該大鼠具有較高的焦慮度和緊張感。

大鼠曠場(chǎng)反應(yīng)箱高35 cm,底邊長(zhǎng)100 cm,內(nèi)壁全黑,底面平均分為16個(gè)小方格,正上方1.5 m處安裝一數(shù)碼攝像頭,使其視野可覆蓋整個(gè)曠場(chǎng)內(nèi)部。在安靜的環(huán)境下,將大鼠逐個(gè)放在開口的黑色木盒里,同時(shí)進(jìn)行攝像和計(jì)時(shí)。每只大鼠接受1次測(cè)試,將小鼠面朝墻放入4個(gè)拐角方格之一,并讓其自由探索環(huán)境5 min。每次實(shí)驗(yàn)后清洗方箱內(nèi)壁及底面,以免上次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物余留的信息(如動(dòng)物的大小便、氣息)影響下次實(shí)驗(yàn)結(jié)論,之后更換動(dòng)物繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。記錄和觀察大鼠在邊緣和中間區(qū)域的時(shí)間、速度、行走路程等,同時(shí)還包括潛伏期、周邊時(shí)間、直立次數(shù)(2只前爪離地)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用SPSS軟件進(jìn)行分析,結(jié)果采用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示。分析組間差異時(shí)采用T-test和One-way ANOVA方法進(jìn)行,ns 表示無顯著性差異；*表示P<0.05；**表示P<0.01；***表示P<0.001。

2 結(jié) 果

2.1 公平條件下的社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)實(shí)驗(yàn)

2.1.1 鉛暴露導(dǎo)致大鼠表現(xiàn)出從屬性行為特征

實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過計(jì)算不同行為類別的分?jǐn)?shù)來獲得,即總進(jìn)攻得分:側(cè)面威脅、直立、扭打、壓制和追逐的總和;總探索評(píng)分:社交探索、生殖器嗅探和社交行為的總和。統(tǒng)計(jì)每只大鼠在籠子里的社會(huì)優(yōu)勢(shì)特征行為次數(shù),并計(jì)算10 min內(nèi)每只大鼠不同行為與總觀察時(shí)間的百分比,分析其顯著性。記錄的行為參數(shù)應(yīng)覆蓋觀察時(shí)間的100%,這有利于更加公正地解釋結(jié)果。

將每次實(shí)驗(yàn)的同組大鼠的特征行為相加進(jìn)行整體分析,可以觀察到不同組的普遍情況而并非個(gè)體。所有數(shù)據(jù)整理后的結(jié)果如圖1所示。

圖1 慢性鉛暴露導(dǎo)致大鼠表現(xiàn)出從屬性行為特征

從圖1可以看出,空白對(duì)照組的社會(huì)優(yōu)勢(shì)行為所占比例顯著高于鉛暴露組，表明生命早期持續(xù)的鉛暴露嚴(yán)重?fù)p傷了大鼠在社會(huì)等級(jí)中的競(jìng)爭(zhēng)能力,而整體上表現(xiàn)出從屬性的行為特征。

2.1.2 益生菌攝入修復(fù)鉛鼠的從屬性行為特征

本文研究益生菌是否能夠修復(fù)鉛鼠的從屬性行為特征如圖2所示。

圖2 益生菌攝入改善鉛暴露大鼠的從屬性行為特征

從圖2可以看出,腸道益生菌的攝入能夠明顯修復(fù)鉛鼠在社會(huì)等級(jí)競(jìng)爭(zhēng)中的弱勢(shì)地位,并且能夠修復(fù)到與空白對(duì)照組差不多的水平。表明益生菌攝入可以修復(fù)慢性鉛暴露大鼠的從屬性行為。

2014年，國(guó)務(wù)院發(fā)布實(shí)施《珠江-西江經(jīng)濟(jì)帶發(fā)展規(guī)劃》，提出要把北江等重要干支流航道和支撐保障系統(tǒng)加快建設(shè)。隨后廣東省把北江定位為建設(shè)21世紀(jì)海上絲綢之路的延伸加快開發(fā)，于2014年啟動(dòng)大宗貨物綠色運(yùn)輸北江示范項(xiàng)目，同年8月啟動(dòng)北江千噸級(jí)航道擴(kuò)能升級(jí)工程建設(shè)，項(xiàng)目總投資約70億元。其中在孟洲壩、濛浬、白石窯、飛來峽、清遠(yuǎn)等五處水利樞紐，新建復(fù)線船閘共7座，清遠(yuǎn)樞紐二線船閘將于2019年4月建成投入使用，其它船閘主體工程將于2021年前先后完工。正式拉開加快內(nèi)河水運(yùn)發(fā)展、建設(shè)黃金水道的序幕。

2.2 水剝奪實(shí)驗(yàn)

2.2.1 鉛削弱大鼠在資源剝奪實(shí)驗(yàn)中的地位

為了進(jìn)一步驗(yàn)證鉛暴露確實(shí)能夠?qū)е麓笫笤谏鐣?huì)優(yōu)勢(shì)行為中的競(jìng)爭(zhēng)能力,本文對(duì)大鼠進(jìn)行水剝奪實(shí)驗(yàn)。2只大鼠在缺水的情況下會(huì)互相爭(zhēng)搶水源,占有水資源更久的一方則表現(xiàn)更加強(qiáng)勢(shì)。統(tǒng)計(jì)每組大鼠的喝水時(shí)間相加占總喝水時(shí)間的百分比,結(jié)果如圖3所示。

圖3 鉛暴露大鼠在資源剝奪實(shí)驗(yàn)中的表現(xiàn)

從圖3可以看出,第1次實(shí)驗(yàn)時(shí)2組大鼠的喝水時(shí)間占比并無顯著性差異,而在第2、3次實(shí)驗(yàn)時(shí),由于各組老鼠在實(shí)驗(yàn)之前是分籠飼養(yǎng)的,彼此之間還未存在等級(jí)關(guān)系,而在經(jīng)過實(shí)驗(yàn)形成社會(huì)秩序和等級(jí),使得空白對(duì)照組的喝水時(shí)間占比逐漸增多。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，早期鉛暴露能夠影響大鼠在資源剝奪實(shí)驗(yàn)中的競(jìng)爭(zhēng)能力。

2.2.2 益生菌攝入改善鉛鼠在資源剝奪中地位

之前的實(shí)驗(yàn)表明早期鉛暴露削弱大鼠在資源剝奪實(shí)驗(yàn)中的競(jìng)爭(zhēng)能力,接下來本文探究益生菌的腸道攝入是否能夠改善這種現(xiàn)象,結(jié)果如圖4所示。

由圖4可以看出,第1次和第2次實(shí)驗(yàn)時(shí)2組大鼠的喝水時(shí)間占比并無顯著性差異,但是在第2天的實(shí)驗(yàn)中鉛+益生菌組具有優(yōu)于鉛組的趨勢(shì),同時(shí)在第3天時(shí)社會(huì)等級(jí)已經(jīng)形成,因此在喝水時(shí)間上體現(xiàn)出顯著的差異。

圖4 益生菌攝入對(duì)改善鉛暴露大鼠的競(jìng)爭(zhēng)能力影響

2.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

研究表明某些社會(huì)行為與焦慮情緒表現(xiàn)出明顯關(guān)系,本文擬進(jìn)一步對(duì)上述實(shí)驗(yàn)條件下SD大鼠的焦慮行為進(jìn)行檢測(cè),以確定早期鉛暴露影響的是大鼠的社會(huì)優(yōu)勢(shì)行為而非焦慮情緒。統(tǒng)計(jì)每組小鼠進(jìn)入曠場(chǎng)中心區(qū)域的數(shù)據(jù)如圖5所示。

圖5 鉛暴露與益生菌攝入對(duì)大鼠焦慮情緒的影響

由圖5a可知,進(jìn)入中心區(qū)域探索的時(shí)間,即從大鼠身體2/3進(jìn)入中心區(qū)域開始計(jì)算大鼠在中心區(qū)域活動(dòng)的總時(shí)間;由圖5b可知,潛伏時(shí)間即大鼠從進(jìn)入曠場(chǎng)到第1次進(jìn)入中心區(qū)域時(shí)經(jīng)歷的時(shí)間;由圖5c可知,進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)即大鼠在5 min內(nèi)總共進(jìn)入中心區(qū)域的次數(shù)。

從圖5可以看出,鉛暴露以及益生菌的攝入對(duì)大鼠的焦慮情緒無顯著影響,表明早期鉛暴露與益生菌攝入對(duì)大鼠社會(huì)行為的影響與其焦慮無關(guān)。

3 討 論

生活環(huán)境的破壞對(duì)動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育都有著十分不利的影響,尤其是早期生活環(huán)境受損可能會(huì)使動(dòng)物的大腦發(fā)育造成異常。已有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)早期重金屬暴露增加成年動(dòng)物自閉癥行為,早期飲用水鉛等重金屬的暴露可導(dǎo)致后代行為的缺陷,多次行為異常,且這種情況會(huì)持續(xù)到成年。有研究表明發(fā)育期鉛暴露能導(dǎo)致多動(dòng)癥的發(fā)生,損傷大鼠神經(jīng)系統(tǒng)[18-19]。

腸道微生物與機(jī)體健康息息相關(guān),能夠促進(jìn)腸道的消化吸收、代謝和免疫等[20-21],同時(shí)也與某些疾病的發(fā)生有關(guān)。在本文研究中,早期鉛暴露會(huì)對(duì)大鼠社會(huì)優(yōu)勢(shì)行為造成影響,腸道微生物的改變可能是其影響機(jī)制。這種影響具體表現(xiàn)為:早期鉛暴露影響大鼠的社會(huì)優(yōu)勢(shì)行為,表現(xiàn)為在群體里的活躍度不高、較為膽小,與其他大鼠斗爭(zhēng)時(shí)也表現(xiàn)出較為弱勢(shì)的一面。而益生菌的攝入可以恢復(fù)鉛暴露對(duì)大鼠社會(huì)優(yōu)勢(shì)行為的影響。這種恢復(fù)過程可能是大鼠通過長(zhǎng)期食用益生菌使得腸道微生物調(diào)整,這種調(diào)整通過神經(jīng)系統(tǒng)影響大腦,促進(jìn)了大鼠特定腦區(qū)神經(jīng)元的改變和生長(zhǎng),從而使得大鼠的社會(huì)行為恢復(fù)。

綜上,益生菌給宿主帶來的好處不僅是腸胃的健康,還會(huì)給其大腦、神經(jīng)系統(tǒng)帶來很大的幫助。但是益生菌影響神經(jīng)系統(tǒng)的具體機(jī)制依然有待探究,如益生菌攝入后定殖于腸道的具體位置;其改善機(jī)體健康的分子機(jī)制,影響大腦的分子路徑;起作用的是菌體本身還是其代謝產(chǎn)物等問題都亟待解決。