李延輝，方茅，謝敏如，夏明汗

1東莞市石碣醫(yī)院病理科，廣東 東莞523290

2廣州醫(yī)學(xué)院病理教研室，廣州510000

3暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院病理科，廣州510000

乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個復(fù)雜、多因素參與的過程，基因表達(dá)調(diào)控異常在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。既往臨床對腫瘤細(xì)胞增殖相關(guān)基因的調(diào)控主要集中在轉(zhuǎn)錄水平，事實上，翻譯過程的異常調(diào)控也與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。研究顯示，在包括乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中，參與真核生物蛋白質(zhì)合成的真核起始因子（eukaryotic initiation factor，eIF）的各種亞基表達(dá)水平發(fā)生了明顯變化，其與惡性腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移及患者的預(yù)后密切相關(guān)[1-2]。由于 eIF3b結(jié)構(gòu)的特殊性，在eIF3復(fù)合物中起腳手架的作用，目前，大量研究提示，eIF3b通過調(diào)控蛋白翻譯的過程參與細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、侵襲和遷移等相關(guān)信號通路，影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展[3-4]。但目前尚無以eIF3b為切入點揭示調(diào)控乳腺癌增殖、凋亡、侵襲和遷移的相關(guān)信號通路的研究。本研究檢測了乳腺癌組織中eIF3bmRNA和eIF3b蛋白的表達(dá)情況，分析其與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系，進(jìn)而探討eIF3b在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用和相關(guān)機(jī)制，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2016年11月至2018年11月東莞市石碣醫(yī)院和暨南大學(xué)附屬一院收治的乳腺癌患者。納入標(biāo)準(zhǔn)：病理學(xué)診斷確診為浸潤性乳腺癌，接受根治性手術(shù)治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；術(shù)前接受放、化療或內(nèi)分泌治療等抗腫瘤治療；臨床資料不完整。依據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，本研究共納入45例女性乳腺癌患者，年齡31～72歲，平均年齡為（54.6±8.5）歲。取45例乳腺癌患者手術(shù)切除的乳腺癌組織和相應(yīng)的癌旁組織，癌旁組織取自距乳腺癌邊緣約2 cm的組織，均經(jīng)病理檢查診斷為正常乳腺組織。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要試劑和儀器 互補DNA（complementary DNA，cDNA）逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自美國Invitrogen公司，兔抗人eIF3b多克隆抗體購自美國Abeam公司，二步法檢測試劑盒購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，eIF3b、β-actin引物均由中國上海博尚生物有限公司合成。

1.2.2 實時定量RT-PCR法檢測eIF 3 bmRNA的相對表達(dá)量 取乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織標(biāo)本，按照操作說明提取總RNA，加入100 μl裂解液研磨成勻漿狀，置入1.5 ml離心管中12 000 r/min，離心 15 min，以 Trizol法抽提總 RNA。以 1 μg 的RNA為模板，按照RT-PCR逆轉(zhuǎn)試劑盒操作說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參，擴(kuò)增條件：94℃ 5 min，94℃ 30s、57℃ 30s、72℃ 30s共45個循環(huán)。采用實時定量PCR法計算eIF3bmiRNA的相對表達(dá)量。eIF3b上游引物：5'-CGGTGCCTTAGCGTTTGTG-3'，下游引物：5'-CGGTCCTTGTTGTTCTTCTGC-3'；β-actin上游引物：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，下游引物：5'-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3'。

1.2.3 免疫組化法檢測eIF 3 b蛋白的陽性表達(dá)率 嚴(yán)格按照免疫組化二步法試劑盒操作說明書進(jìn)行，組織常規(guī)切片，脫臘水化，采用3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原修復(fù)，封閉。滴加一抗（稀釋濃度為1∶1000），4℃孵育過夜，沖洗后滴加二抗（稀釋濃度為1∶2000），37℃孵育，沖洗后二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色，蘇木素復(fù)染，脫水透明，封片。以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered solution，PBS）代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定[5]：eIF3b蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)，細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色顆粒為陽性表達(dá)。按染色強度評分：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕褐色為3分。按陽性細(xì)胞所占百分比評分：＜5%為0分，5%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，≥75%為4分。根據(jù)兩項評分的乘積判斷陽性結(jié)果，≥6分判斷為陽性，＜6分則為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 18.0軟件對所-有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 eIF 3 b mRNA相對表達(dá)量的比較

乳腺癌組織中eIF3bmRNA的相對表達(dá)量為（2.85±0.22），明顯高于癌旁組織的（1.02±0.23），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t=53.634，P＜0.01）。

2.2 eIF 3 b蛋白陽性表達(dá)率的比較

乳腺癌組織中eIF3b蛋白的陽性表達(dá)率為75.56%（34/45），明顯高于癌旁組織的17.78%（8/45），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=30.179，P＜0.01）。

2.3 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF 3 b mRNA相對表達(dá)量和eIF 3 b蛋白陽性表達(dá)率的比較

不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、組織學(xué)分級乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3bmRNA相對表達(dá)量的比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3bmRNA相對表達(dá)量的比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（t=4.921、3.360，P＜0.05）。不同年齡、病理類型、腫瘤直徑、組織學(xué)分級乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3b蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；不同腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、TNM分期乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF3b蛋白陽性表達(dá)率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=7.228、8.427，P＜0.05）。（表1）

3 討論

eIF3是由a～m共13個亞基組成的多亞基真核細(xì)胞起始因子eIf，也是最大最復(fù)雜的起始因子，分子量為550～700 kD。eIF3參與了真核翻譯起始進(jìn)程中大多數(shù)的反應(yīng)。eIF3可以調(diào)控不同類型mRNA的翻譯起始過程，從而選擇性地調(diào)控蛋白的合成，最終調(diào)控細(xì)胞的生長[6]。研究顯示，eIF3可調(diào)控腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程并影響細(xì)胞周期，如a、b、e和k亞基均可能參與細(xì)胞周期調(diào)控[7-8]。多項研究顯示，在腫瘤細(xì)胞的增殖和惡性轉(zhuǎn)化中，翻譯過程可能出現(xiàn)調(diào)控異常，但腫瘤的發(fā)生發(fā)展與翻譯調(diào)控失常之間的機(jī)制目前尚未研究清楚[9-11]。因此，直接參與這些生物學(xué)行為的關(guān)鍵因子，如eIF4E、eIF4G和eIF3亞基等將成為新的抗腫瘤治療的潛在靶點，成為研究熱點。其中eIF3的亞基eIF3b參與了蛋白翻譯和細(xì)胞周期的調(diào)控及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。2012年，Liang等[12]發(fā)現(xiàn)，eIF3b在膠質(zhì)瘤組織和細(xì)胞中高表達(dá)；Wang等[13]下調(diào)結(jié)腸癌細(xì)胞株中eIF3b的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的生長被有效抑制，細(xì)胞周期發(fā)生停滯。2013年，Wang等[14]將敲除eIF3b的膀胱癌細(xì)胞注射到裸鼠皮下，觀察細(xì)胞成瘤及肺轉(zhuǎn)移的效果，結(jié)果顯示，eIF3b可提供高腫瘤細(xì)胞的克隆形成能力，促進(jìn)細(xì)胞轉(zhuǎn)移；該研究者同時提出，eIF3b可能通過整合素/黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又稱AKT）信號通路參與調(diào)控膀胱癌的發(fā)生與黏附過程。

表1 不同臨床特征乳腺癌患者乳腺癌組織中eIF 3 b mRNA的相對表達(dá)量和eIF 3 b蛋白陽性表達(dá)情況（n=45）

本研究為探討eIF3的亞基eIF3b在乳腺癌組織中的表達(dá)及在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用，檢測了乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織中eIF3bmRNA和eIF3b蛋白的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，45例乳腺癌組織中eIF3bmRNA的相對表達(dá)量和eIF3b蛋白的陽性表達(dá)率均明顯高于癌旁組織，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），表明eIF3b在乳腺癌發(fā)生的過程中可能發(fā)揮著重要作用，提示eIF3b可能成為一種新的乳腺癌診斷標(biāo)志物。此外，乳腺癌組織中eIF3bmRNA的相對表達(dá)量和eIF3b蛋白的陽性表達(dá)率與乳腺癌患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，eIF3bmRNA和eIF3b蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)可能與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期有關(guān)（P＜0.05），表明eIF3b不僅可能參與了乳腺癌發(fā)生過程，也可能在乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮促進(jìn)作用，被認(rèn)為可作為乳腺癌新的治療靶點。這可能是因為eIF3b是直接參與蛋白合成的關(guān)鍵因子，其異常表達(dá)可能參與了調(diào)控乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移的過程，深入研究其調(diào)控作用機(jī)制，可能提供更直接、更有效的分子靶點治療新策略，是下一步研究的方向。

綜上所述，eIF3b表達(dá)增高不僅可能參與了乳腺癌發(fā)生過程，也可能在乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲過程中發(fā)揮促進(jìn)作用。