文／謝開飛 通訊員 歐陽桂蓮

在現(xiàn)代遺傳學中，反向遺傳學被認為是一種不可或缺的工具，它徹底改變了人們對病毒發(fā)病機制和疫苗研發(fā)的認識。近日，一項來自瑞士的研究使用這一工具，依靠已知新冠病毒基因序列，在酵母菌中快速構(gòu)建出了活的新冠病毒。

研究人員認為，快速構(gòu)建出活的新冠病毒，可以成為向衛(wèi)生部門和實驗室提供傳染性病毒毒株的替代方法，從而爭取時間對疫情暴發(fā)做出快速反應。該研究中所用的反向遺傳學技術(shù)是什么？在生物科技領(lǐng)域有哪些應用？這種重建病毒的最新研究如何改變對疫苗研發(fā)的認識？

由里及表 開辟疫苗研發(fā)新思路

“一直以來，科學家們研究相關(guān)基因的功能，都是通過雜交等手段，觀察表型性狀的變化，從而研究遺傳基因的存在與變化，這種由表及里的研究方法稱為正向遺傳學?！睆B門大學國家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心副教授程通告訴記者，如在醫(yī)學領(lǐng)域，可以觀察臨床病人病理組織和正常組織的不同表現(xiàn)，從而探究產(chǎn)生這種表現(xiàn)變化的內(nèi)在原因。

隨著分子遺傳學及相關(guān)實驗技術(shù)的發(fā)展，科研人員已經(jīng)能夠有目的地對DNA進行重組或者定點突變。于是，在現(xiàn)代遺傳學中，就出現(xiàn)了另一條由里及表的認知路線。研究人員直接從生物自身基因出發(fā)，通過對特定基因進行敲除、定點突變等人工操作后，觀察突變體表型與性狀變化，從而反推基因功能。由于該路線與正向遺傳學正好相反，所以這個新的遺傳學分支被稱為反向遺傳學，包括基因剔除技術(shù)、基因改造等研究。

相較于正向遺傳學來說，反向遺傳學有其獨特的優(yōu)勢。

此前，美國哈佛—麻省理工博德研究所科學家塞克·凱斯利森及其同事，就采用反向遺傳學方法，對10503個生活在巴基斯坦的人基因編碼區(qū)進行測序分析，識別出了約50000個突變。這種反向推定的技術(shù)路線，相當于高效收集了正向敲除1317個基因找到的結(jié)果，相較于傳統(tǒng)正向遺傳方法，極大地提高了效率。

“與滅活疫苗、減毒疫苗等經(jīng)典疫苗研發(fā)方法相比，反向遺傳學操作還具有減毒途徑明確、效率高、毒力回復率低等優(yōu)點，是疫苗研制的新方向?！背掏ㄕf。

目前，科研人員利用反向遺傳學技術(shù)，已證實登革熱病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、委內(nèi)瑞拉馬腦炎病毒和乙型腦炎病毒等一系列病毒的毒力相關(guān)位點，通過基因突變、缺失、重排等方法，都有可能獲得理想的減毒株來研制疫苗。

據(jù)介紹，基于反向遺傳學技術(shù)的疫苗研究，還可以發(fā)現(xiàn)在經(jīng)典疫苗研發(fā)過程中難以發(fā)現(xiàn)的“特殊”保護性抗原，為傳染性疾病的疫苗研制，以及發(fā)展新型多價或廣譜疫苗提供新的方向和思路。

補充病毒資源 加速檢測技術(shù)開發(fā)和藥物篩選

在新冠病毒感染者病例已經(jīng)大規(guī)模出現(xiàn)的情況下，科學家們?yōu)槭裁催€要對其進行人工重建？程通表示，重建病毒將有助于人類了解病毒復制途徑，找到其“弱點”和藥物作用靶點，是研制病毒相關(guān)疫苗與治療藥物不可或缺的技術(shù)手段。

雖然新冠肺炎病例已大規(guī)模出現(xiàn)，但不同地域毒株常存在差異性，且出于生物安全的考慮，無法在全球范圍內(nèi)任意運輸，導致眾多科研機構(gòu)因缺乏新冠病毒資源而難以快速鑒定病毒、驗證相關(guān)疫苗或治療藥物的有效性。

“新冠病毒重建技術(shù)的突破，使得處于不同國家與地區(qū)的科學家，能夠在各自所處的高等級生物安全實驗室內(nèi)，借助大腸桿菌、酵母菌等基因工程常用微生物，合成當前數(shù)據(jù)庫里具有完整基因組序列的新冠病毒活毒株。”程通說，這有助于解決相關(guān)藥物評價的關(guān)鍵資源問題，將加快針對新冠病毒的檢測、治療和預防手段的研發(fā)。

另一方面，重建病毒還為發(fā)現(xiàn)毒力位點與作用機制等提供了工具。通過對新冠病毒進行基因敲除、改變以及其他加工修飾，研究這些基因改造對其致病性的影響，有助于深入了解病毒致病機制，發(fā)現(xiàn)可用作藥物靶點的新型毒力基因。

此外，通過給病毒加上熒光蛋白等可視化標記，還可實現(xiàn)病毒感染實時監(jiān)控，從而優(yōu)化現(xiàn)有新冠病毒的細胞與動物感染模型，為相關(guān)疫苗與藥物高通量快速篩選進一步提供方便。

目前，國內(nèi)外科研機構(gòu)在重建病毒過程中，尚無法脫離反向遺傳學范疇?？蒲腥藛T大都是基于在大腸桿菌或酵母菌等基因工程類微生物內(nèi)，克隆與改造病毒遺傳物質(zhì)，然后將提純的病毒基因組轉(zhuǎn)運到宿主細胞中進行活病毒的組裝生產(chǎn)。

《科學》雜志曾經(jīng)報道的脊髓灰質(zhì)炎病毒重建，由科研人員使用無細胞體外系統(tǒng)完成。由于需要基于該病毒的基因組序列信息來進行實驗，當時就將其歸屬于一種特殊的反向遺傳學操作方式。

應用日益廣泛 但須受到嚴格監(jiān)管且符合科學倫理

當前，反向遺傳學技術(shù)不僅在不同種類病毒研究上得到非常普遍的應用，而且在疫苗和藥物研發(fā)上也展現(xiàn)出重要的應用價值。

程通舉例說，基于反向遺傳學技術(shù)改造減毒活疫苗的研究，已在包括2009甲型H1N1流感病毒、登革熱病毒、禽流感病毒、水痘—帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒等多種病毒中取得重要進展。

其中，2009甲型H1N1減毒活疫苗已上市并廣泛接種，水痘—帶狀皰疹病毒、單純皰疹病毒、人巨細胞病毒和登革熱病毒等病毒的反向遺傳改造減毒活疫苗，已進入臨床試驗階段。

此外，基于反向遺傳學技術(shù)合成的減毒病毒載體或溶瘤病毒類藥物，已廣泛用于基因治療與腫瘤治療臨床研究。2015年，美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準首個溶瘤病毒類藥物T-VEC用于治療晚期黑色素瘤；2017年，美國杜克大學研發(fā)的溶瘤脊髓灰質(zhì)炎病毒，獲得了FDA的批準，用于治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

除了用于重建病毒，反向遺傳學技術(shù)在細菌等其他微生物，以及植物相關(guān)研究上也有廣泛應用，并取得了較大進展。

“在細菌研究方面，反向遺傳學技術(shù)在B群腦膜炎球菌疫苗、肺炎鏈球菌多價疫苗、肺炎衣原體疫苗、炭疽桿菌疫苗等多種細菌性疾病疫苗的研制中，獲得了成功應用?！背掏ㄕf。其中，B群腦膜炎球菌通用疫苗的成功研制是運用反向遺傳學技術(shù)研發(fā)細菌疫苗的經(jīng)典案例。

B群腦膜炎球菌是流行性腦脊髓膜炎的病原菌，可導致兒童與青少年患急性化膿性腦膜炎和敗血癥。然而長期以來，科學家們應用傳統(tǒng)技術(shù)研制有效和廣譜的預防疫苗，一直無法獲得成功。

隨著基因組學和蛋白質(zhì)組學技術(shù)的進步，瑞士諾華公司的研究人員應用反向遺傳學技術(shù)，通過分析B群腦膜炎球菌的全基因組，并進一步通過基因組序列比較和動物模型測試篩選，研制出多價B群腦膜炎球菌通用疫苗。

2013年，諾華公司重組B群腦膜炎球菌疫苗獲得歐盟批準上市，成為歐洲第一個獲得批準的預防B群腦膜炎球菌病的疫苗，并在控制B群腦膜炎球菌流行中被證明安全有效。

“需要特別指出，通過反向遺傳學技術(shù)重建病毒，是推進相關(guān)科學研究的有力工具，但這些實驗操作必須受到嚴格的監(jiān)管，需符合科學倫理，并嚴格限定在合格的生物安全實驗室中開展。”程通說。