田 薇，王秀英，吳歡聽，劉玉蘭，許 嘯*，汪文俊

（1.中南民族大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北武漢 430074；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023）

甘氨酸（Glycine，Gly）作為結(jié)構(gòu)最簡單的氨基酸，常被認(rèn)為是一種非必需氨基酸，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，Gly 對于幼齡哺乳動(dòng)物是一種條件性必需氨基酸，它在動(dòng)物胎兒和幼齡階段對機(jī)體發(fā)育有著極其重要的作用[1-2]。Gly 具有抗炎和免疫功能，體外添加Gly 對白細(xì)胞（如巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等）具有調(diào)控作用[3-4]。肝臟是機(jī)體代謝的重要器官，特別還是解毒和免疫防御的主要器官[5]。仔豬在早期斷奶應(yīng)激下，環(huán)境中的致病性和非致病性抗原會刺激肝臟巨噬細(xì)胞產(chǎn)生并釋放大量的炎性因子，從而損傷肝臟[5]。Toll 樣受體（TLRs）和核苷酸結(jié)合寡聚域受體（NODs）是調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)的2 個(gè)重要蛋白家族。本課題組前期以脂多糖（LPS）刺激構(gòu)建的肝臟損傷模型中，肝臟TLRs 和NODs 信號通路相關(guān)基因的表達(dá)會顯著上調(diào)，引發(fā)炎癥反應(yīng)[6]。因此，本試驗(yàn)在斷奶仔豬日糧中添加Gly，再用LPS 刺激構(gòu)建肝臟炎癥模型，探討Gly 對斷奶仔豬血細(xì)胞數(shù)及肝臟炎癥的影響，為養(yǎng)豬生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 本試驗(yàn)選用24 頭體重（7.17±0.41）kg的健康杜×長×大三元雜交斷奶仔豬，按體重相近及公母各半原則隨機(jī)分為4 個(gè)處理，即對照組（生理鹽水+基礎(chǔ)日糧）、LPS 組（LPS+基礎(chǔ)日糧）、1.0% Gly 組（LPS+基礎(chǔ)日糧+1.0% Gly）和2.0% Gly 組（LPS+基礎(chǔ)日糧+2.0% Gly）。每個(gè)處理6 個(gè)重復(fù)（欄），每欄1 頭豬。本試驗(yàn)基礎(chǔ)日糧滿足《豬飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（2004）仔豬營養(yǎng)需要量[7]，配方及營養(yǎng)成分見表1。各組日糧用丙氨酸進(jìn)行等氮處理。試驗(yàn)期共28 d，在試驗(yàn)第28 天，LPS組、1.0% Gly 組和2.0% Gly 組注射100 μg/kg 體重的LPS，對照組注射等量的生理鹽水。

1.2 試驗(yàn)材料 試驗(yàn)所需的L-Gly 和L-丙氨酸購自武漢阿米諾科技有限公司，有效成分均高于99%。LPS 購自Sigma 公司，為大腸桿菌血清型055：B5，注射時(shí)用生理鹽水溶解成500 μg/mL 溶液。注射劑量為0.2 mL/kg BW（即100 μg/kg 體重）。

表1 基礎(chǔ)日糧原料組成與營養(yǎng)成分（飼喂基礎(chǔ)）

1.3 飼養(yǎng)管理 本試驗(yàn)在武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)豬場進(jìn)行。豬欄尺寸為1.20 m×1.10 m。試驗(yàn)期間舍內(nèi)溫度在25～27℃。試驗(yàn)采用粉料飼喂，仔豬自由采食和飲水，并定期進(jìn)行免疫和驅(qū)蟲。

1.4 樣品采集 試驗(yàn)第28 天對仔豬腹膜注射LPS 后4 h，先通過前腔靜脈采集血液樣品，保存于5 mL EDTA 抗凝真空采血管中置于冰上待測。然后利用戊巴比妥鈉將仔豬麻醉并屠宰，取肝臟樣品置于冰上，取一小塊肝臟組織用于形態(tài)學(xué)觀察（4% 多聚甲醛固定，然后HE 染色）。同時(shí)用冷生理鹽水沖洗后切成立方小塊，立刻轉(zhuǎn)入液氮速凍，然后置于-80℃冰箱待測。

1.5 測定指標(biāo)與方法 肝臟組織形態(tài)學(xué)觀察肝臟組織形態(tài)學(xué)切片采用HE 染色，主要包括脫蠟、染色、脫水透明及封片等步驟。切片的觀察方法和評價(jià)依據(jù)主要是利用HPIAS-1000 高清晰度彩色圖文分析系統(tǒng)對已染色的肝臟組織切片做定性觀察，每張切片選10 個(gè)顯微鏡視野，觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)及病理變化[8]。血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)采用Siemens ADVIA?2120i 全自動(dòng)血液分析儀測定。TLRs 和NODs 信號通路關(guān)鍵基因mRNA 表達(dá)量的測定參照冷煒博[8]的方法。引物合成方法為先根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫所提供的豬的基因組序列為模板，然后利用軟件Premier 6.0 設(shè)計(jì)對應(yīng)的引物，合成自武漢擎科生物技術(shù)有限公司，引物序列詳見表2。內(nèi)參基因?yàn)棣?actin，目標(biāo)基因的mRNA 相對表達(dá)量參照Livak 等[9]的方法計(jì)算。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較。統(tǒng)計(jì)結(jié)果用平均值和SEM 表示。以P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Gly 對LPS 刺激斷奶仔豬肝臟形態(tài)學(xué)的影響 由圖1 可知，對照組肝細(xì)胞索排列整齊，肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整。與對照組相比，LPS 刺激后肝臟組織結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷，具體表現(xiàn)為肝細(xì)胞索排列紊亂，肝血竇大量炎性細(xì)胞浸潤，大量肝細(xì)胞出現(xiàn)不同程度損傷，即肝細(xì)胞空泡化、核固縮、溶解。添加Gly 緩解了LPS 刺激導(dǎo)致的仔豬肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)損傷，表現(xiàn)為肝細(xì)胞索排列較整齊，肝血竇少量炎性細(xì)胞浸潤，少量肝細(xì)胞出現(xiàn)空泡化。

2.2 Gly 對LPS 刺激斷奶仔豬血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響由表3 可知，與對照組相比，LPS 刺激后顯著改變了仔豬血液中白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板的數(shù)量。與LPS 組相比，在日糧中添加2% Gly 顯著提高了LPS 刺激的斷奶仔豬血液中白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞和血小板數(shù)量。

2.3 Gly 對LPS 刺激仔豬肝臟炎癥信號通路相關(guān)基因表達(dá)的影響 由表4 可知，與對照組相比，LPS 刺激后顯著提高了斷奶仔豬肝臟TLR4、MyD88、NOD1、NOD2、RIP2、TNF-α基因的表達(dá)量。與LPS 組相比，在日糧中添加1% Gly 顯著降低了LPS 刺激斷奶仔豬肝臟中MyD88和NOD1基因的表達(dá)量；添加2% Gly 顯著降低了MyD88、NOD1、NOD2、RIP2基因的表達(dá)量。

3 討 論

血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)是反映動(dòng)物機(jī)體健康水平的重要參數(shù)，主要由白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血小板等相關(guān)指標(biāo)構(gòu)成。血液中的白細(xì)胞由多種細(xì)胞亞群構(gòu)成，主要有嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等，它們對機(jī)體免疫應(yīng)答保護(hù)作用的方式和機(jī)制各不相同[10]。白細(xì)胞作為機(jī)體主要免疫活性細(xì)胞，可通過其游走性、趨化性和吞噬作用來抵御和消滅入侵的病原微生物，從而保護(hù)機(jī)體健康，在機(jī)體正常情況下，白細(xì)胞總數(shù)和亞群的數(shù)量相對穩(wěn)定，但在機(jī)體免疫功能下降時(shí)白細(xì)胞及亞群會有不同程度減少[11]。本試驗(yàn)中對斷奶仔豬注射LPS，顯著降低了白細(xì)胞及亞群（嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞）的數(shù)量，表明LPS 刺激降低了仔豬的免疫功能；在仔豬日糧中添加2% Gly 可顯著提高血液中白細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞的數(shù)量，說明Gly 可以通過提高嗜中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞來提高機(jī)體的免疫力。血小板是從骨髓成熟的巨核細(xì)胞胞質(zhì)裂解脫落下來的具有生物活性的小塊胞質(zhì)，無細(xì)胞核，它除了參與凝血活動(dòng)外，還可促進(jìn)淋巴細(xì)胞定向運(yùn)動(dòng)使與有害細(xì)菌接觸后凝集，同時(shí)，活化的血小板還可以吞噬細(xì)菌和病毒，釋放某些功能蛋白和自由基發(fā)揮抗微生物的作用[12]。本試驗(yàn)中，LPS 刺激斷奶仔豬導(dǎo)致血液中血小板指數(shù)顯著降低；而添加1%或2% Gly 可顯著緩解LPS 導(dǎo)致的血小板指數(shù)下降。王浩等[13]也發(fā)現(xiàn)LPS 可誘導(dǎo)血小板凋亡，說明在炎癥條件下血小板的數(shù)量和功能會受到影響。而添加Gly 可以提高血小板數(shù)量，說明Gly 可增強(qiáng)機(jī)體的凝血功能，減少機(jī)體受感染的風(fēng)險(xiǎn)。前人研究表明，Gly 有增強(qiáng)機(jī)體抗氧化水平和免疫功能的作用[14-15]，這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，Gly 可能通過提高白細(xì)胞及血小板的數(shù)量來增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

表2 引物序列、目的片段及基因文庫

表3 Gly 對LPS 刺激斷奶仔豬血細(xì)胞分類計(jì)數(shù)的影響

表4 Gly 對LPS 刺激斷奶仔豬肝臟炎癥信號通路基因表達(dá)量的影響

本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功建立了LPS 誘導(dǎo)的仔豬肝臟免疫應(yīng)激模型，主要表現(xiàn)為在LPS 刺激4 h 后仔豬肝臟中炎性因子水平升高、炎癥相關(guān)信號通路因子基因表達(dá)升高等[16-17]。TLRs 與NODs 信號通路均與機(jī)體炎癥密切相關(guān)，TLRs 可以跨膜作用，而NODs 主要存在于細(xì)胞內(nèi)，此2 條炎癥相關(guān)信號通路均是通過識別病原高度保守結(jié)構(gòu)，從而啟動(dòng)發(fā)揮免疫功能[18-19]。本試驗(yàn)中斷奶仔豬在LPS 刺激4 h 后TLRs（TLR4、MyD88、TNF-α）和NODs（NOD1、NOD2、RIP2）信號通路關(guān)鍵因子基因表達(dá)量顯著上升，說明LPS 導(dǎo)致了肝臟炎癥，這與肝臟HE 染色切片結(jié)果相一致，LPS 誘導(dǎo)的肝臟炎癥對肝細(xì)胞發(fā)生了損傷；在日糧中添加2% Gly 可顯著緩解TLRs（MyD88）和NODs（NOD1、NOD2、RIP2）信號通路相關(guān)因子基因表達(dá)量的上升，說明Gly 可以通過調(diào)節(jié)炎癥信號通路TLRs 和NODs 來緩解LPS 引起的肝臟炎癥，從肝臟HE 染色切片結(jié)果來看，添加Gly 可改善LPS 刺激引起的肝細(xì)胞損傷。目前，有關(guān)Gly 對肝臟TLRs 和NODs 炎癥信號通路的研究鮮有報(bào)道。但有研究發(fā)現(xiàn)Gly 可以改善LPS 刺激引起的斷奶仔豬肝臟能量代謝紊亂，并可調(diào)控糖酵解和三羧酸循環(huán)等代謝途徑中相關(guān)酶的表達(dá)[20]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Gly 可以通過調(diào)節(jié)斷奶仔豬腸道TLR4 和NODs 信號通路來緩解LPS誘導(dǎo)的腸道炎癥[21]。所以，本試驗(yàn)中LPS 刺激導(dǎo)致肝臟炎性因子表達(dá)升高，而Gly 通過緩解TLR4 和NODs信號通路相關(guān)因子的表達(dá)來緩解了肝臟的炎癥。

4 結(jié) 論

在本試驗(yàn)條件下，在斷奶仔豬日糧中添加2% Gly可以緩解LPS 刺激導(dǎo)致的肝臟TLRs（MyD88）和NODs（NOD1、NOD2、RIP2）炎性信號通路相關(guān)因子的過量表達(dá)，也可以提高白細(xì)胞（嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞）和血小板的數(shù)量，從而緩解肝臟炎癥。