陳進(jìn)城 林 榮 張圓芳 董繼泉 柳維林 江 征 陳少清 王薌斌 何 堅(jiān)

1福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬康復(fù)醫(yī)院，福建 福州350003；2福建省康復(fù)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350003；3福建中醫(yī)藥大學(xué)康復(fù)醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350122；4湖州市南潯區(qū)人民醫(yī)院，浙江 湖州313000* 通信作者：何堅(jiān)，E-mail：591003659@qq.com

頸型頸椎病是頸椎病的早期分型，伴隨著其他類型頸椎病的發(fā)展過程［1］，頸部疼痛是其最常見的癥狀［2］。成年人口中患病率為48.5%，長期使用電腦工作者的患病率為 55%［3-4］。IL-1β、IL-6、TNF-α 等作為促炎細(xì)胞因子在頸椎退變發(fā)展過程中起重要作用，NF-κB（nuclear factor-κB）信號(hào)通路已被證明可以調(diào)節(jié)IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎細(xì)胞因子和趨化因子的轉(zhuǎn)錄，從而導(dǎo)致和加速頸椎的退變［5-6］。miR-146a通過其重要的靶基因TRAF-6發(fā)揮抗炎功能，通過抑制靶基因TRAF-6的水平和減少TLR4下游NF-κB的表達(dá)從而減少炎癥因子的水平［7］。芍藥甘草湯出自《傷寒論》?，F(xiàn)代研究證明其具有抗炎、解痙之功效，被廣泛應(yīng)用于臨床各種疾?。?-9］。本課題組前期研究已證實(shí)芍藥甘草湯對(duì)頸型頸椎病的疼痛和痙攣均具有顯著的療效［10］。為探究芍藥甘草湯對(duì)頸型頸椎病炎癥損傷的作用，本研究通過建立頸椎病兔模型，觀察芍藥甘草湯對(duì)兔頸后肌炎癥損傷的作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

選取6月齡SPF級(jí)新西蘭白兔（3.0～3.5 kg）38只，雌雄各半，由福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心代購，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2012-0011。

1.2 試劑及儀器

蘇木素伊紅染液（碧云天，美國）；IL-1β、IL-6、TNF-α（ELISA）試劑盒（上海西唐生物）；RT-qPCR試劑盒（艾德萊，北京）；兔子固定裝置（蘇州蘇杭科技器材有限公司）；酶標(biāo)儀（Tecan，瑞士）；包埋機(jī)（Leica，德國）；電子顯微鏡（Leica，德國）；PCR 分析儀（Bio-Rad，美國）；Anti-NFκB Antibody，p65 subunit，active subunit，clone 12H11（Merck Millipore，美國）；Anti-MyD88 Antibody（aa263-273）（Isbio，美國）。

1.3 模型的建立與評(píng)估

1.3.1 兔頸型頸椎病模型的建立 參照張圓芳等［11］寒濕型兔頸型頸椎病模型進(jìn)行造模。將兔子剃除頸部毛發(fā)后置于兔子固定裝置中，將其頸部前屈45°固定，于頸后放上平整的冰袋，冰袋兩端固定在裝置上，每次5 h，每天1次，連續(xù)干預(yù)8周后將動(dòng)物置于室溫25～28℃中飼養(yǎng)，自由飲食、飲水。

1.3.2 兔頸型頸椎病模型的評(píng)估 造模后第2天，兔耳源靜脈采血，觀察兔血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平；觀察兔頸肌的僵硬程度。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組與給藥

1.4.1 分組 將38只6月齡的新西蘭白兔按照隨機(jī)數(shù)字表法分為正常組6只和造模組32只，造模后剔除不合格的和造模中死亡的兔子，再隨機(jī)分為模型組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組6只。

1.4.2 給藥 芍藥甘草湯方由白芍12 g、炙甘草12 g組成；所用藥材購自福建中醫(yī)藥大學(xué)承創(chuàng)堂河洛中醫(yī)館。按此量（24 g）為60 kg成人每日臨床用藥有效量計(jì)算，按人與兔體質(zhì)量系數(shù)折算公式進(jìn)行換算：

給兔子服用高、中、低劑量的芍藥甘草湯分別是成人用藥等效劑量的2、1、0.5倍，故根據(jù)公式算得高劑量組、中劑量組、低劑量組兔子每千克體質(zhì)量用藥量分別為16、8、4 g／kg。每周對(duì)兔子測量體質(zhì)量1次，根據(jù)兔子的具體體質(zhì)量和每兔日服藥量公式計(jì)算出每只兔子每天所需藥材量，進(jìn)而計(jì)算出每組兔子的日需藥材量。將藥材用自動(dòng)煎藥機(jī)常規(guī)煎法，再用小火濃縮，每劑中藥均濃縮煎至160 mL，每次80 mL，每日2次；正常組和模型組予以等量的生理鹽水，連續(xù)給藥4周。

1.5 取材及樣本處理

1.5.1 血清標(biāo)本的采集 分別于造模前1天上午、造模結(jié)束后第2天上午和芍藥甘草湯干預(yù)結(jié)束后第2天上午，對(duì)5組兔子均進(jìn)行耳緣靜脈采血，并收集于標(biāo)記好的采血管中，及時(shí)于4℃，轉(zhuǎn)速3000 r／min，進(jìn)行離心，離心30 min后吸取血清上清液，-80℃冰箱保存。

1.5.2 頸后肌組織標(biāo)本的采集 采用空氣栓塞法處死動(dòng)物，后迅速取出頸后肌組織，一般取C3-6棘突旁約2 cm處的肌肉部分約1 cm3。將取下的組織分2個(gè)部分，一部分投入裝有4%多聚甲醛的EP管中固定，用作HE染色；另一部分置于EP管中，封蓋，-80℃冰箱保存，用作RT-qPCR檢測。

1.6 ELISA法檢測血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平

5組血清按ELISA的說明書進(jìn)行操作；酶標(biāo)儀吸收450 nm波長檢測A值。各孔檢測的A值減去空白組的A值為各孔實(shí)際A值，來反映血清中IL-1β、IL-6、TNF-α 的含量。

1.7 HE染色觀察兔頸頸后肌組織形態(tài)的變化

將取下的頸后肌組織放入4%多聚甲醛中固定48 h，后放入10%EDTA脫鈣，室溫脫鈣60 d。脫鈣完成后，進(jìn)行石蠟包埋，制作石蠟切片，切片厚度為5 μm，常規(guī)脫蠟后，蘇木素染色5 min，自來水沖洗30 s，1%鹽酸分色3 s后，再用自來水沖洗30 s，PBS返藍(lán)30 min，再用蘇木素復(fù)染1 s。對(duì)每張切片依次進(jìn)行常規(guī)逆梯度酒精脫水，最后用中性樹膠封片，常溫晾干，顯微鏡下觀察兔頸后肌組織形態(tài)的變化。

1.8 Western blot法檢測兔頸后肌組織蛋白的表達(dá)

收集頸后肌組織，將其在液氮中迅速研磨成細(xì)致粉末，研磨后加入蛋白裂解液按1 mg∶3 μL進(jìn)行裂解，每20 min震蕩1次，2 h后取混合液至于1.5 mL離心管中4℃ 14 000 r／min離心 30 min，收集上清液，吸取上清液200 μL置于0.6 mL離心管中，加入50 μL蛋白上樣緩沖液；在95℃下變性5 min，根據(jù)BCA蛋白定量結(jié)果上樣，通過SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳凝膠分離并轉(zhuǎn)移至PVDF膜，轉(zhuǎn)膜后用高效封閉液室溫封閉30 min。分別加入針對(duì)β-actin（1∶10 000）、NF-κB P65（1∶800）、MyD88（1∶1 500）的一抗4℃孵育過夜。TBST洗滌緩沖液洗3次，每次10 min，加入二抗，在室溫下保持2 h，TBST洗滌緩沖液洗 3次，每次 10 min；使用 ImageQuant LAS 4000微型化學(xué)發(fā)光成像分析系統(tǒng)，并使用ImageJ軟件分析條帶密度，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 RT-qPCR法檢測兔頸后肌組織中miR-146a、TLR4及TRAF-6的mRNA表達(dá)

從-80℃冰箱中取出兔頸后肌標(biāo)本組織，液氮研磨成細(xì)粉后，各取75 mg粉末于1.5 mL EP管中，加入 1 mL Lysis／Binding buffer、200 μL 氯仿、無水乙醇等混勻攪拌，將混合液每次以700 μL加入至一個(gè)吸附柱RA中，多次離心后，取出吸附柱RA，提取總RNA。總RNA經(jīng)處理后，根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將純化的RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qPCR擴(kuò)增。最后在熒光定量儀器中根據(jù)熒光定量試劑盒進(jìn)行操作，設(shè)置的反應(yīng)條件為：95℃30 s，95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。計(jì)量資料服從正態(tài)分布均采用（±s）表示，選用單因素方差分析檢驗(yàn)組間差異的顯著性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 模型評(píng)估

在整個(gè)造模操作過程中，兔頸后肌肉組織慢慢從柔軟變得痙攣、僵硬；造模結(jié)束后，兔頸后肌肉組織出現(xiàn)更明顯的條索狀肌痙攣癥狀，證明本次兔頸型頸椎病模型的成功建立。

造模結(jié)束后，除正常組在造模前后沒有明顯變化外，其他5組動(dòng)物的相應(yīng)血清炎癥因子表達(dá)水平均比造模前顯著升高，且造模4組與正常組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而造模4組之間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），這也證明了本次兔頸型頸椎病模型的成功建立。見表1。

表1 干預(yù)前（造模后）5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in five groups before intervention （after modeling） （±s）pg／mL

表1 干預(yù)前（造模后）5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 表達(dá)水平比較（±s）Table 1 Comparison of expression levels of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α in five groups before intervention （after modeling） （±s）pg／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01.

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 I L-1 β 3.8 4±0.1 0 1 3.4 6±0.1 8 1）1 3.6 7±0.2 3 1）1 3.7 7±0.2 0 1）1 3.6 0±0.2 1 1）I L-6 2.6 9±0.1 3 9.0 2±0.1 4 1）8.8 8±0.1 7 1）8.8 0±0.2 7 1）8.8 3±0.2 5 1）T N F-α 4.5 5±0.0 8 9.4 1±0.4 0 1）9.3 4±0.3 4 1）9.3 0±0.3 9 1）9.3 6±0.3 1 1）

2.2 ELISA法檢測5組血清中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α 的水平

見表2。

表2 干預(yù)后5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α expression in five groups after intervention （±s）pg／mL

表2 干預(yù)后5組血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平比較（±s）Table 2 Comparison of serum inflammatory factors IL-1β，IL-6 and TNF-α expression in five groups after intervention （±s）pg／mL

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01；與低劑量組比較，3） P＜0.01；與中劑量組比較，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01;Compared with the model group,2)P＜0.01;Compared with the low dose group,3)P＜0.01;Compared with the middle dose group,4)P＜0.01.

組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 I L-1 β 3.8 4±0.0 9 1 4.7 5±0.5 9 1）1 1.3 8±0.4 5 2）7.2 1±0.4 5 2）3）4.8 4±0.3 8 2）3）4）I L-6 2.6 9±0.1 3 9.2 7±0.3 0 1）6.6 0±0.3 3 2）5.3 7±0.2 9 2）3）3.3 0±0.2 6 2）3）4）T N F-α 4.5 5±0.0 8 9.6 9±0.2 3 1）8.1 7±0.3 1 2）6.5 9±0.3 0 2）3）5.2 2±0.1 6 2）3）4）

2.3 HE染色觀察5組頸后肌形態(tài)的變化

正常組肌細(xì)胞核橢圓形，頸肌纖維排列有序；模型組肌細(xì)胞變形，肌纖維斷裂，斷裂處出現(xiàn)大量炎癥細(xì)胞；低劑量組細(xì)胞核數(shù)量較模型組增多；中劑量組細(xì)胞核增加更明顯，肌纖維斷裂減少；高劑量組細(xì)胞核較多，炎癥細(xì)胞比中劑量組的更少。見圖1。

圖1 5組頸后肌形態(tài)變化（×400）Figure 1 Morphological changes of the posterior cervical muscle in five groups （×400）

2.4 Western blot法檢測兔頸后肌組織蛋白的表達(dá)

見表3和圖2。

表3 干預(yù)后 5組頸后肌組織中 MyD88、NF-κB P65 蛋白表達(dá)（±s）Table 3 Protein expression of MyD88 and NF-κB P65 in posterior cervical muscles in five groups after intervention （±s）

表3 干預(yù)后 5組頸后肌組織中 MyD88、NF-κB P65 蛋白表達(dá)（±s）Table 3 Protein expression of MyD88 and NF-κB P65 in posterior cervical muscles in five groups after intervention （±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the low dose group,3)P＜0.05;Compared with the middle dose group,4)P＜0.01.

N F-κ B P 6 5 0.6 3±0.0 4 2.8 4±0.2 1 1）2.0 3±0.0 1 2）1.3 6±0.2 0 2）3）0.6 4±0.0 5 2）3）4）組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 M y D 8 8 0.3 5±0.0 6 3.2 5±0.3 3 1）2.4 0±0.3 0 2）1.4 4±0.1 1 2）3）0.3 8±0.0 6 2）3）4）

2.5 RT-qPCR法檢測兔頸后肌中miR-146a、TLR4及TRAF-6的mRNA表達(dá)

見表4。

3 討 論

頸型頸椎病屬于頸椎病的早期分型，主要有酸脹、疼痛等不適，少數(shù)可伴有上肢的感覺異常［12-13］。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)頸前屈時(shí)，頸椎所承受的壓力增大，容易使其損傷、退變［14］。 本研究參照張圓芳等［11］的方法建立兔頸型頸椎病模型，操作簡便，成功率高，與臨床實(shí)際基本相符。研究發(fā)現(xiàn)長期低頭姿勢能夠引起兔頸椎炎癥損傷的產(chǎn)生，而炎癥反應(yīng)是引起頸椎退變的重要原因之一［15］。IL-1β被認(rèn)為是最重要的細(xì)胞因子，具有強(qiáng)烈的促炎活性，通過刺激產(chǎn)生多種促炎癥介質(zhì)，如細(xì)胞因子、趨化因子和基質(zhì)金屬蛋白酶［16-17］。此外，IL-1β 通過誘導(dǎo)細(xì)胞衰老凋亡促進(jìn)氧化應(yīng)激并加速細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而加速頸椎退變［18］。TNF-α的水平與頸椎病患者的頸椎疼痛密切相關(guān)，TNF-α通過增加神經(jīng)生長因子和血管內(nèi)皮生長因子的產(chǎn)生，促進(jìn)神經(jīng)血管的生長，它還促進(jìn)基質(zhì)降解和增強(qiáng)物質(zhì)p，這表明TNF-α可能與神經(jīng)痛苦反應(yīng)或促進(jìn)結(jié)構(gòu)中斷相關(guān)［19］。KISHIMOTO等［20］提出，IL-6是一種參與細(xì)胞增殖和分化、維持免疫穩(wěn)態(tài)、巨噬細(xì)胞功能等關(guān)鍵功能的多功能細(xì)胞因子。經(jīng)證實(shí)，IL-6作為促炎細(xì)胞因子，可導(dǎo)致繼發(fā)性損傷［21-22］。本研究對(duì)血清樣本進(jìn)行了評(píng)估，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，芍藥甘草湯干預(yù)組中血清炎癥因子比模型組明顯降低，這說明芍藥甘草湯能明顯降低兔血清中炎癥因子的表達(dá)，從而抑制炎癥反應(yīng)。

圖2 干預(yù)后5組頸后肌組織中MyD88、NF-κB P65蛋白表達(dá)Figure 2 Protein expression of MyD88 and NF-κB P65 in posterior cervical muscles in five groups after intervention

NF-κB存在于不同類型的細(xì)胞中，是一個(gè)重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，影響著細(xì)胞的生長、分化、凋亡等［23］。病毒、細(xì)菌、促炎性細(xì)胞因子等都會(huì)刺激NF-κB信號(hào)通路，引起NF-κB信號(hào)通路的激活，進(jìn)而導(dǎo)致一系列相關(guān)疾病的發(fā)生。NF-κB信號(hào)通路對(duì)調(diào)控頸椎退變中的炎癥反應(yīng)起到重要作用，在退變的頸后肌組織中，NF-κB信號(hào)通路被高表達(dá)的IL-6、IL-1β、TNF-α所調(diào)控，引起頸后肌細(xì)胞凋亡、蛋白聚糖降解，加劇了頸后肌的退行性病變［24］，當(dāng)抑制NF-κB活性后，能有效降低炎癥因子IL-6、IL-1β和TNF-α 的表達(dá)水平［25］。

表4 干預(yù)后5組頸后肌組織中miR-146a、TLR4、TRAF-6表達(dá)（±s）Table 4 Expression of miR-146a，TLR4 and TRAF-6 in posterior cervical muscle after intervention （±s）

表4 干預(yù)后5組頸后肌組織中miR-146a、TLR4、TRAF-6表達(dá)（±s）Table 4 Expression of miR-146a，TLR4 and TRAF-6 in posterior cervical muscle after intervention （±s）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05；與低劑量組比較，3） P＜0.05；與中劑量組比較，4） P＜0.01。Note:Compared with the normal group,1)P＜0.01;Compared with the model group,2)P＜0.05;Compared with the low dose group,3)P＜0.05;Compared with the middle dose group,4)P＜0.01.

T R A F-6 0.9 9±0.0 3 2 5.1 6±0.9 2 1）1 1.9 2±0.3 3 2）5.1 8±0.3 3 2）3）2.6 5±0.2 0 2）3）4）組別正常組模型組低劑量組中劑量組高劑量組n 6 6 6 6 6 m i R-1 4 6 a 1.0 0±0.0 3 0.0 4±0.0 1 1）0.2 0±0.0 2 2）0.4 7±0.0 2 2）3）0.9 9±0.0 5 2）3）4）T L R 4 1.0 0±0.0 7 1 4.3 0±0.5 0 1）9.2 1±0.3 5 2）5.8 3±0.2 8 2）3）2.0 8±0.2 6 2）3）4）

miRNA是一類小的非編碼RNA分子，可以作為許多途徑和生物過程（包括炎癥反應(yīng)）的調(diào)節(jié)劑發(fā)揮關(guān)鍵作用。miR-146a作為協(xié)調(diào)免疫和炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的最重要的miRNA之一，通常通過其公認(rèn)的靶基因IL-1受體相關(guān)激酶1（IRAK1）和腫瘤壞死因子（TNF）受體相關(guān)因子 6（TRAF6）發(fā)揮作用［7，26-27］，活化的IRAK1和TRAF6可引起NF-κB核位移，促進(jìn)炎癥介質(zhì)的釋放。研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào)miR-146a細(xì)胞后可負(fù)性調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)的釋放［7］。TLR4是一種膜結(jié)合蛋白，激活的TLR4可募集下游細(xì)胞內(nèi)MyD88和TRIF蛋白，MyD88通過miR-146a的靶基因形成MyD88-IRAKs-TRAF-6復(fù)合體參加信號(hào)傳導(dǎo)，最終促進(jìn)下游NF-κB通路的激活，釋放炎癥因子［28］。本實(shí)驗(yàn)RT-qPCR法檢測顯示，干預(yù)后，高、中、低劑量組miR-146a的表達(dá)均升高，TLR4、TRAF-6的表達(dá)均降低，說明芍藥甘草湯可以提高兔頸后肌中miR-146a的表達(dá)，降低 TLR4和TRAF-6的表達(dá)，且高劑量效果最佳。

4 結(jié) 論

芍藥甘草湯減輕兔頸后肌的炎癥損傷，其作用機(jī)制可能是兔頸后肌組織中miR-146a通過抑制其重要的靶基因TRAF-6的水平減少TLR4下游NF-κB信號(hào)通路釋放IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子。