韓易辰 趙桂芝 趙冰凈 肖依寒 申 濤 柯 杰

正畸牙齒移動(dòng)(Orthodontic Teeth Movement，OMT)是在力的作用下牙周支持組織改建進(jìn)行的，多種蛋白(細(xì)胞因子、趨化因子、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白等)參與其中，通過(guò)特定蛋白的含量變化可以幫助了解牙周組織對(duì)力的反應(yīng)。骨硬化蛋白(Sclerostin)由SOST 基因編碼[1]，是由成熟骨細(xì)胞特異分泌的一種糖蛋白，在骨代謝過(guò)程中起到重要作用，能夠抑制由成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成[2]。目前慢性牙周炎及種植體周?chē)l溝液中骨硬化蛋白的含量受到越來(lái)越多的關(guān)注[3-5]，但正畸治療過(guò)程中，齦溝液中骨硬化蛋白含量變化鮮有研究，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)檢測(cè)下頜擴(kuò)弓牙齒移動(dòng)過(guò)程中齦溝液中骨硬化蛋白濃度變化，初步探究其與骨代謝的關(guān)聯(lián)，以期為監(jiān)測(cè)下頜擴(kuò)弓骨改建提供一個(gè)可行的生化指標(biāo)，從而提高下頜擴(kuò)弓的安全性。

1. 資料和方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019 年1 月至2019 年6月來(lái)空軍特色醫(yī)學(xué)中心口腔科進(jìn)行上下頜聯(lián)合擴(kuò)弓治療的患者25 例，男11 例，女14 例，年齡11～14 歲，平均年齡12.4±1.1 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)上、下頜輕中度擁擠伴有牙弓狹窄；(2)未做過(guò)正畸治療；(3)混合牙列期患者前牙與第一磨牙已萌出；(4)無(wú)顱面畸形及綜合癥；(5)無(wú)系統(tǒng)性疾病，牙周組織健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：有系統(tǒng)性疾病，骨代謝疾病，口腔衛(wèi)生較差，依從性差者。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備階段：拍攝全口曲面斷層片及頭顱側(cè)位片；分別取上下頜模型，制作上下頜擴(kuò)弓器；對(duì)患者及家長(zhǎng)進(jìn)行口腔衛(wèi)生宣教；為納入實(shí)驗(yàn)的患者行全口齦上潔治術(shù)；患者家長(zhǎng)簽署知情同意書(shū)。

固定矯治階段：牙周潔治一周后，將制作好的擴(kuò)弓器帶入患者口內(nèi)，旋轉(zhuǎn)中央螺絲橫向打開(kāi)擴(kuò)弓器的螺旋擴(kuò)大結(jié)構(gòu)，每次加力旋轉(zhuǎn)1/ 4 圈橫向擴(kuò)大牙弓0.25mm，對(duì)患者采取上頜快速擴(kuò)弓，每天通常加力兩次(0.5mm/ 天)，下頜采用中快速擴(kuò)弓技術(shù)，每天通常加力一次(0.25mm/ 天)，一周復(fù)查一次[6];唇側(cè)粘MBT 托槽(3M)，上下頜帶入0.016″熱激活鎳鈦圓絲[6];根據(jù)患者擁擠度及耐受情況采取上頜擴(kuò)弓約20 天，下頜擴(kuò)弓約40 天。擴(kuò)弓器保持6 個(gè)月后，拆除擴(kuò)弓器。

臨床數(shù)據(jù)采集階段：帶入擴(kuò)弓器前T0、下頜加力結(jié)束時(shí)T1、保持3 個(gè)月T2、保持6 個(gè)月拆除擴(kuò)弓器后T3四個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別拍攝CBCT，對(duì)下頜第一前磨牙和第一磨牙的頰側(cè)進(jìn)行牙周臨床指標(biāo)檢查(牙周探診深度PD、牙齦退縮水平GR、臨床附著喪失CAL、菌斑指數(shù)PLI、牙齦指數(shù)GI)以及齦溝液采集。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 齦溝液的采集 分別選取下頜雙側(cè)第一前磨牙、第一磨牙的頰側(cè)采集齦溝液，先用水流輕柔的沖洗受試牙，并使用棉卷隔離，持無(wú)油壓縮氣槍沿牙面輕吹，保持靜置1 分鐘。然后將whatman 濾紙條(2mm×10mm，每個(gè)EP 管中1 條，共同用精確電子天平稱重并記錄)插入齦溝內(nèi)1mm，保持30s 后取出，將濾紙條放入原保存的EP 管內(nèi)，精確電子天平再次稱重，取前后重量差值即采集齦溝液的質(zhì)量；觀察濾紙條有無(wú)血液污染，若沾及血液即廢棄，10min 后重新收集；按照1mg/ μl的齦溝液比重計(jì)算齦溝液體積并記錄后，即刻加入100μl PBS 緩沖液，置- 80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩Ｋ袠颖揪赏幻麑?shí)驗(yàn)者采集。

1.3.2 齦溝液中骨硬化蛋白含量的測(cè)定 采用ELISA 法(海聯(lián)生物人骨硬化蛋白試劑盒)檢測(cè)齦溝液中骨硬化蛋白含量，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，雙側(cè)同一牙位取平均值:

a. 將人骨硬化蛋白試劑盒從冰箱中取出，平衡30 分鐘，使①20×洗滌緩沖液②檢測(cè)抗體- HRP③96 孔微孔酶標(biāo)板④樣本稀釋液⑤底物A⑥底物B⑦終止液⑧標(biāo)準(zhǔn)品(6 管)恢復(fù)至室溫(18- 25℃)；

b. 按1 份洗滌緩沖液加19 份蒸餾水的配比(1∶20)稀釋20×洗滌緩沖液；

c. 分別設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、待測(cè)樣本孔：標(biāo)準(zhǔn)品孔加標(biāo)準(zhǔn)品(分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μl)、空白孔加樣本稀釋液50μl、待測(cè)樣本孔加待測(cè)樣本各50μl，輕輕震蕩混勻；

d. 標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔、待測(cè)樣本孔中每孔加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)(HRP)標(biāo)記的檢測(cè)抗體100μl，覆上封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋恒溫溫育1 小時(shí)；

e. 棄去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，并在吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液(350μl)，靜置1 分鐘，甩去洗滌液，吸水紙上拍干。按照以上步驟，重復(fù)洗板5 次；

f. 每孔分別加入底物A、底物B 各50μl，37℃避光恒溫孵育15 分鐘；

g. 每孔加入終止液50μl，在反應(yīng)終止后15分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度(OD 值)。

h. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及OD 值計(jì)算出樣本濃度- OD 值曲線，代入各孔的OD 值，計(jì)算出各孔樣本的濃度；各孔樣本的濃度*樣本體積/ 齦溝液體積即得到相應(yīng)齦溝液中骨硬化蛋白濃度，左右同名牙結(jié)果取平均值。

1.3.3 臨床牙周指標(biāo)檢查 牙周探診深度(Probing Depth，PD): 用Williams 刻度探針沿牙長(zhǎng)軸方向插入牙齦溝底，記錄頰、舌側(cè)，近中、遠(yuǎn)中位置的牙齦緣至齦溝底的距離，取最大值作為PD 值。

牙齦退縮水平(Gingival Recession，GR): 用Williams 刻度探針沿牙長(zhǎng)軸方向插入齦溝探及釉牙骨質(zhì)界，記錄頰、舌側(cè)，近中、遠(yuǎn)中位置的牙齦緣至釉牙骨質(zhì)界的距離，取最大值作為GR 值。

臨床附著喪失(Clinical Attachment Loss，CAL)：當(dāng)齦緣位于CEJ 根方時(shí)，CAL=PD+GR；當(dāng)齦緣位于CEJ 冠方時(shí)，CAL=PD- GR；當(dāng)齦緣平齊CEJ 時(shí)，PD=GR，CAL=0 值。

菌斑指數(shù)(Plaque Index，PLI): 根據(jù)菌斑的量和厚度來(lái)計(jì)分，計(jì)分標(biāo)準(zhǔn): 0= 無(wú)菌斑; 1= 牙面可見(jiàn)薄層菌斑，視診不可見(jiàn)，但探針尖側(cè)面可刮出菌斑; 2= 可見(jiàn)中量菌斑; 3= 可見(jiàn)大量軟垢。

牙齦指數(shù)(Gingival Index，GI)：0= 牙齦健康；1= 牙齦輕度炎癥：牙齦的顏色有輕度改變并輕度水腫，探診不出血；2= 牙齦中等炎癥：牙齦色紅，水腫光亮，探診出血；3= 牙齦嚴(yán)重炎癥：牙齦明顯紅腫或有潰瘍，并有自動(dòng)出血傾向。

1.3.4 影像學(xué)檢查 患者的全部CBCT 數(shù)據(jù)均由口腔科同一名放射科醫(yī)生使用同一臺(tái)設(shè)備進(jìn)行采集，將采集的影像學(xué)資料導(dǎo)入到Invivo 5 軟件中，調(diào)整頭位：使患者在矢狀向上頜面部中線與基準(zhǔn)水平線垂直，在冠狀向上在咬合平面與基準(zhǔn)水平線平行，水平向上雙側(cè)頜骨及牙列基本對(duì)稱。之后在水平軸的視圖下，選中剛好通過(guò)右側(cè)下頜第一磨牙根分叉的水平面，進(jìn)行頰側(cè)牙槽骨厚度的測(cè)量。

牙齒頰側(cè)牙槽骨厚度BB[29]：下頜第一前磨牙取牙根頰側(cè)最外側(cè)點(diǎn)到頰側(cè)皮質(zhì)骨外側(cè)面的距離，下頜第一磨牙取近遠(yuǎn)中根頰側(cè)最外側(cè)點(diǎn)連線的中點(diǎn)到頰側(cè)皮質(zhì)骨外側(cè)面的距離，雙側(cè)同名牙測(cè)得數(shù)據(jù)取平均值，分別記作BB 4，BB 6。所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均由同一人重復(fù)三次(每次間隔一周)完成，測(cè)量結(jié)果取其平均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18. 0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以x±s 表示，治療前后比較采用配對(duì)t 檢驗(yàn)，以P≤0. 05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2. 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，同名牙(第一前磨牙與第一磨牙)齦溝液體積T0～T3沒(méi)有明顯差異，但是相同時(shí)間點(diǎn)第一磨牙采集到的齦溝液體積多于第一前磨牙，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同名牙齦溝液骨硬化蛋白GCF Scl濃度T0～T1顯著升高，T1～T2顯著下降，T2～T3顯著下降，但T3較T0沒(méi)有明顯差異，且GCF Scl濃度在T0和T3階段第一前磨牙與第一磨牙之間未見(jiàn)明顯差異(表1，2)；

牙周探診深度PD、牙齦退縮水平GR、臨床附著喪失CAL T0～T3之間的變化并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；牙齦指數(shù)GI、菌斑指數(shù)PLI T1較T0都有顯著升高，但T1～T3之間的變化并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中未見(jiàn)明顯的探診出血(表3)；

同名牙頰側(cè)牙槽骨厚度BB T0～T1顯著下降，T1～T2未見(jiàn)明顯差異，T2～T3略有上升，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但T3較T0仍有顯著下降(表4)；T0～T3相同時(shí)間點(diǎn)第一前磨牙頰側(cè)牙槽骨厚度BB 4 與第一前磨牙頰側(cè)牙槽骨厚度BB 6 未見(jiàn)顯著差異。

表1 檢驗(yàn)指標(biāo)—第一前磨牙

表2 檢驗(yàn)指標(biāo)—第一磨牙

表3 牙周臨床指標(biāo)

表4 影像學(xué)指標(biāo).頰側(cè)牙槽骨厚度

3. 討論

齦溝液是一種血漿衍生滲出物[7]，分析齦溝液中特定成分的含量能夠?yàn)樵u(píng)估局部細(xì)胞代謝提供指導(dǎo)[8]，骨硬化蛋白作為骨形成抑制劑參與牙槽骨的吸收與改建[9]，在人及大鼠的成牙骨質(zhì)細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、牙周組織和牙槽骨骨細(xì)胞中均有表達(dá)[10-12]，并存在于在齦溝液中[3,9]。以往的研究主要集中在牙周組織炎性對(duì)GCF Scl 濃度的影響，但在正畸治療中機(jī)械力對(duì)其影響則鮮有研究。下頜擴(kuò)弓主要依靠機(jī)械力使牙齒頰向移動(dòng)，排除了腭中縫效應(yīng)對(duì)骨硬化蛋白含量的影響，所以本研究選取患者的下頜齦溝液作為研究對(duì)象，研究下頜擴(kuò)弓對(duì)GCF Scl濃度的影響，探究其作為檢測(cè)下頜擴(kuò)弓安全性的生化指標(biāo)的可行性。

本研究測(cè)量下頜擴(kuò)弓開(kāi)始到保持結(jié)束4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)(帶入擴(kuò)弓器前T0、下頜加力結(jié)束時(shí)T1、保持3個(gè)月T2、保持6 個(gè)月拆除擴(kuò)弓器后T3)頰側(cè)GCF Scl 的含量，從結(jié)果可知：下頜擴(kuò)弓機(jī)械力的加載可以使GCF Scl 濃度產(chǎn)生變化。以往的研究[4,7,13,14]已經(jīng)證實(shí)慢性牙周炎患者GCF Scl 含量較健康患者顯著上升，但是，通過(guò)對(duì)牙周臨床指標(biāo)的檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)在佩戴下頜擴(kuò)弓器后，由于托槽及擴(kuò)弓器增加了患者牙齒清潔的難度，PLI 和GI 均有明顯的上升，但是在治療過(guò)程中，未見(jiàn)明顯變化，而且牙周檢查過(guò)程中也未見(jiàn)到明顯的探診出血及顯著探診深度PD 的變化，T2PD 的增加可能是由于牙齒清潔困難導(dǎo)致牙齦生長(zhǎng)的緣故[15]，而并非炎癥狀態(tài)下的附著喪失，以上說(shuō)明下頜擴(kuò)弓并未造成牙周的明顯炎癥，本實(shí)驗(yàn)中GCF Scl 的含量變化主要是下頜擴(kuò)弓過(guò)程中機(jī)械力的作用。結(jié)合GCF Scl 的變化與CBCT 結(jié)果，我們可以發(fā)現(xiàn)：

(1)T0～T1時(shí)，隨著機(jī)械力的刺激，使牙周組織中骨硬化蛋白表達(dá)增加，此時(shí)骨形成受抑制，骨吸收作用明顯，所以表現(xiàn)為頰側(cè)牙槽骨厚度降低；

(2)T1～T2時(shí)，由于擴(kuò)弓器停止加力，牙周組織中骨硬化蛋白表達(dá)逐漸降低，但仍然高于正常水平，此時(shí)骨吸收作用仍然顯著，但是頰側(cè)牙槽骨厚度并沒(méi)有顯著變化，可能是由于此時(shí)骨形成作用也逐漸加強(qiáng)，并與骨吸收作用達(dá)到一個(gè)平衡。King GJ 等[16]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)力的作用下的壓力側(cè)骨改建會(huì)首先經(jīng)歷3 到5 天的骨吸收作用，隨后經(jīng)過(guò)5 到7 天的逆轉(zhuǎn)期，之后的7 到14 天將以骨形成為主要過(guò)程；Rober 等[17]對(duì)骨代謝生化指標(biāo)的綜述中也提到在力的作用下骨改建過(guò)程，骨吸收的相關(guān)指標(biāo)會(huì)在力的刺激后1 到3 個(gè)月率先升高，骨形成的相關(guān)生化指標(biāo)會(huì)在隨后6 到9 個(gè)月升高。Giuseppe Perinetti[18]等測(cè)量上頜擴(kuò)弓時(shí)頰側(cè)齦溝液中ALP的含量，發(fā)現(xiàn)在擴(kuò)弓結(jié)束保持3 個(gè)月到6 個(gè)月時(shí)，其含量顯著性的持續(xù)升高，ALP 作為骨形成的生物學(xué)標(biāo)記物，其含量的增加可以說(shuō)明從擴(kuò)弓結(jié)束保持3 個(gè)月到6 個(gè)月的時(shí)間里，骨形成作用在不斷加強(qiáng)，并且相同的過(guò)程可能也發(fā)生在下頜擴(kuò)弓治療過(guò)程中。所以隨著骨吸收作用不斷減弱和骨形成作用不斷加強(qiáng)，在T1～T2時(shí)，二者可能維持一個(gè)相對(duì)平衡，導(dǎo)致CBCT 數(shù)據(jù)測(cè)量上未見(jiàn)到頰側(cè)牙槽骨厚度的顯著變化，但是，此時(shí)GCF Scl 表達(dá)仍高于初始水平，骨吸收作用應(yīng)該仍處于活躍狀態(tài)；

(3)T2～T3時(shí)，牙周組織中骨硬化蛋白表達(dá)逐漸降低至初始水平，骨吸收作用逐漸恢復(fù)到正常狀態(tài)，這個(gè)過(guò)程中，骨形成作用仍然顯著，進(jìn)而使得頰側(cè)牙槽骨厚度逐漸增加。但是此時(shí)牙槽骨厚度依舊低于初始狀態(tài)，結(jié)合Rober 等人的研究，提示在擴(kuò)弓加力結(jié)束6 個(gè)月后，骨形成作用可能仍會(huì)持續(xù)，所以頰側(cè)牙槽骨厚度可能T3在之后仍會(huì)有進(jìn)一步增加的可能，需要進(jìn)一步的研究觀察。

下頜擴(kuò)弓加力過(guò)程中，齦溝液中骨硬化蛋白含量的變化能夠一定程度上提示加力過(guò)程中骨吸收的狀態(tài)和趨勢(shì)，但是結(jié)合相關(guān)的骨形成生物指標(biāo)變化能夠更好的反映骨代謝狀態(tài)，指導(dǎo)下頜擴(kuò)弓過(guò)程中對(duì)力的控制。

此外，有研究[13,14]使用與本實(shí)驗(yàn)相同的GCF Scl 采集及檢驗(yàn)方法，發(fā)現(xiàn)慢性牙周炎患者GCF Scl含量上升，但是與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相比較, GCF Scl 的含量變化要遠(yuǎn)大于牙周炎患者，可能是由于GCF Scl 對(duì)于力的敏感性要優(yōu)于慢性炎癥，這也為其成為診斷骨吸收有效的生化檢驗(yàn)指標(biāo)提供了可能性。

傳統(tǒng)的診斷手段如牙周探診PD 或X 線診斷等缺乏預(yù)見(jiàn)性，Scl 作為骨形成的抑制劑，GCF Scl可能在影像學(xué)檢查和臨床檢查發(fā)現(xiàn)骨吸收之前便發(fā)生改變，并且GCF 的采集無(wú)創(chuàng)、方便，易儲(chǔ)存，并可以在正畸治療的各個(gè)階段重復(fù)采集。

由此可見(jiàn)，GCF Scl 以其靈敏度高、采集無(wú)創(chuàng)、儲(chǔ)存方便等優(yōu)點(diǎn)有望成為一種監(jiān)測(cè)牙槽骨吸收狀態(tài)的臨床上簡(jiǎn)單易行的生物指標(biāo)。