不穩(wěn)定性心絞痛是由于冠狀動脈不穩(wěn)定性斑塊的破裂伴發(fā)血栓形成引起的急性心血管事件，不穩(wěn)定斑塊的破裂是其發(fā)生、發(fā)展的病理生理基礎。如何篩選出與不穩(wěn)定性心絞痛相關的特異性生物標志物，敏感性更高、特異性更強，是心血管專業(yè)所面臨的重大課題[1-2]。近年來蛋白質(zhì)組學技術的飛速發(fā)展，為其提供了新的思路和技術平臺[3]。蛋白質(zhì)組學是指一個生物體/組織/細胞所表達的整套蛋白質(zhì)，是研究特定組織在不同時空情況下全部蛋白質(zhì)表達和功能的技術，有助于尋找疾病診治的新標志物。血清標本的取材相對簡便，容易獲取，是較為理想的臨床樣本[4-7]，本研究以不穩(wěn)定性心絞痛患者的血清為研究對象，希望能找出與之相關的特異蛋白質(zhì)。

1 對象與方法

1.1 對象入選2018年1—11月在空軍特色醫(yī)學中心就診的患者，共200例，臨床懷疑冠心病（主要表現(xiàn)為異常心電圖、胸痛不適和/或心肌核素檢查異常），年齡45～75歲，所有患者行冠狀動脈造影檢查，依據(jù)冠狀動脈造影結(jié)果分為2組：造影陰性為正常對照組，冠狀動脈有不同程度狹窄為不穩(wěn)定性心絞痛組，各100例。本研究獲得空軍特色醫(yī)學中心醫(yī)學倫理委員會批準，并向患者及其家屬簽署知情同意書。

1.2 主要試劑和儀器ProteoExtract-Albumin/IgC Removal Kit購自德國Merck公司，Immobilized pH gradient IPG 4-7（17 cm）、immobilized pH gradient IPG 3-10（17 cm）購自美國Bio-Rad公司，Human SAA ELISA試劑盒、Human Gelsolin ELISA試劑盒購自美國Invitrogen公司，YM-3超濾膜購自美國Millipore公司，IPGphor等電聚焦儀購自美國GE公司，Ettan DALT Ⅵ垂直平板電泳系統(tǒng)、Typhoon 9410掃描儀購自美國Amersham Biosciences公司，ABI 4800 MALDI-TOF-MS質(zhì)譜儀購自美國Applied Biosystcm公司。

1.3 方法應用雙向熒光差異凝膠電泳（2DEDIGE）和質(zhì)譜分析技術，對不穩(wěn)定性心絞痛及冠狀動脈正常人群各100例，行血清蛋白質(zhì)組學研究，并選取2個具有代表性的差異蛋白應用ELISA進行驗證。血清標本的收集和處理純化、ELISA檢測急性期反應蛋白血清淀粉樣蛋白A2（SAA2）、凝溶膠蛋白（Gelsolin）的濃度均按照相關說明書操作。差異凝膠雙向電泳和質(zhì)譜分析在蛋白質(zhì)組學研究中心進行。

1.4 統(tǒng)計學處理應用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量變量以±s表示，采用方差分析，計數(shù)資料以率（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料比較2組患者在年齡、血壓、血糖、白細胞計數(shù)，是否合并糖尿病、高脂血癥，吸煙與否、阿司匹林、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑/血管緊張素Ⅱ受體拮抗藥（ACEI/ARB）類藥物、β受體-阻斷藥應用比例等各方面比較差異無統(tǒng)計學意義；不穩(wěn)定性心絞痛組的男性患者比對照組多，高敏C反應蛋白（high sensitive c-reactive protein，hs-CRP）水平及服用他汀類藥物比例明顯高于對照組，總膽固醇（total cholesterol，TC）、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平低于對照組（表1）。

表1 2組懷疑冠心病患者的一般資料

圖1 不穩(wěn)定性心絞痛組和對照組的差異表達蛋白譜的熒光重疊圖

2.2 差異蛋白質(zhì)點的質(zhì)譜分析用SDS-PAGE電泳圖比較原血漿和去除IgG和ALB的血漿，經(jīng)過處理的樣品已除去高豐度蛋白。2-DE凝膠分別經(jīng)過3個通道掃描（圖1），分析軟件為DeCyder6.5，對匹配蛋白質(zhì)點的豐度進行差異比較，得到了32個差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）蛋白質(zhì)點，其中有19個點下調(diào)，13個點上調(diào)。利用制備膠分離蛋白樣品，經(jīng)MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜分析，共鑒定到11種19個差異蛋白（表2），存在著翻譯后修飾的情況。SAA2、銅籃蛋白、α-1抗胰蛋白酶α-AT以及結(jié)合珠蛋白、補體系統(tǒng)的C4和C6前體發(fā)生上調(diào)。有載脂蛋白A-Ⅰ，ApoA-Ⅰ，ApoA-Ⅳ及其前體，轉(zhuǎn)鐵蛋白11 kD、7 kD，轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白，細胞骨架的凝溶膠蛋白、凝溶膠蛋白-1亞基、Myosin-11，血紅蛋白β鏈和11 kDa亞基下調(diào)（表2）。

表2 差異蛋白質(zhì)的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

2.3 差異表達蛋白質(zhì)的功能分析對鑒定的蛋白質(zhì)進行分析顯示，差異蛋白質(zhì)涉及到急性期反應、炎癥反應、細胞骨架、脂代謝和能量代謝等多種功能，其中急性期反應蛋白占28.1%、脂代謝蛋白占12.5%、補體系統(tǒng)蛋白占12.5%、細胞骨架蛋白占12.5%、能量代謝相關蛋白占16.7%、纖維蛋白占8.3%，其他功能未知蛋白占8.3%。

2.4 ELISA驗證雙向凝膠電泳的定量結(jié)果為驗證雙向凝膠電泳結(jié)果的可靠性，選取2個具有代表性的差異蛋白，急性期反應蛋白-血清淀粉樣蛋白A2（SAA2）和細胞骨架蛋白-凝溶膠蛋白（Gelsolin），并選取年齡和性別匹配的冠脈正常人（對照組）、穩(wěn)定性心絞痛（穩(wěn)定型心絞痛組）、不穩(wěn)定性心絞痛（不穩(wěn)定性心絞痛組）以及急性心肌梗死（急性心肌梗死組）患者各50例，應用ELISA進行。結(jié)果顯示，SAA2在冠狀動脈正常組和穩(wěn)定心絞痛組患者中表達水平差異無統(tǒng)計學意義，不穩(wěn)定性心絞痛組和急性心肌梗死組患者明顯高于對照組和穩(wěn)定性心絞痛組（P＜0.01），其中急性心肌梗死組最高（圖2）。Gelsolin在對照組、穩(wěn)定性心絞痛組、不穩(wěn)定性心絞痛組和急性心肌梗死組中的表達水平逐漸減低，急性心肌梗死組最低（圖3）。

圖2 SAA2在血清中的表達

圖3 Gelsolin在血清中的表達

3 討論

本研究以不穩(wěn)定性心絞痛患者的血清為研究對象，采用2DE-DIGE-MS方法分析差異蛋白質(zhì)點，并應用ELISA進行驗證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)11種19個差異蛋白質(zhì)點，涉及到急性期反應、炎癥反應、細胞骨架、脂代謝和能量代謝等。

3.1 急性期反應蛋白SAA2、銅籃蛋白、α-1抗胰蛋白酶在不穩(wěn)定性心絞痛中上調(diào)。SAA2屬于急性期蛋白，在機體遭受創(chuàng)傷、手術、感染、燒傷等應激時明顯升高，是反映體內(nèi)炎癥的敏感指標。本研究結(jié)果顯示，急性冠狀動脈綜合征（ACS）時機體伴有明顯的急性期反應，SAA2上調(diào)，和既往文獻報道相一致[8]。銅籃蛋白是人體重要的亞鐵氧化酶，對鐵的轉(zhuǎn)運和平衡起著重要作用。研究證實，銅藍蛋白能夠促進體內(nèi)氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）的形成，在動脈硬化進展中起到一定的作用[9]。本研究結(jié)果顯示，不穩(wěn)定性心絞痛患者銅籃蛋白升高，說明與其進展有關。α-AT是主要炎性反應蛋白之一，屬于蛋白酶抑制因子，在缺血再灌注損傷的急性期表達增高，已有多個研究報道α-AT和ACS密切相關[9]。

3.2 補體系統(tǒng)的C4和C6前體表達上調(diào)補體系統(tǒng)是由血清/組織液中的一組可溶性蛋白及存在于血細胞表面的膜結(jié)合蛋白和補體受體所組成，大量事實證明補體系統(tǒng)與動脈粥樣硬化的病理過程相關，可引起血小板聚集，脂質(zhì)及組織氧化過程[10]。在本研究中，C4B和C6前體表達上調(diào)，說明炎癥反應可能參與了ACS的發(fā)生發(fā)展。

3.3 纖維蛋白升高纖維蛋白是體內(nèi)重要的凝血因子，血漿纖維蛋白水平升高與動脈粥樣硬化嚴重程度密切相關，是冠心病的一個獨立危險因素，纖維蛋白升高提示機體凝血相關蛋白異常，易致血栓形成，促進不穩(wěn)定性心絞痛的發(fā)生發(fā)展。

3.4 ApoA-Ⅰ、ApoA-Ⅳ及其前體表達下調(diào)ApoA-Ⅰ是高密度脂蛋白的主要蛋白成分，ApoA-Ⅰ降低是心肌梗死的獨立危險因素。ApoA-Ⅳ是一種脂結(jié)合蛋白，主要作用是參與脂質(zhì)代謝，ApoA-Ⅳ通過介導HDL與肝細胞的結(jié)合以及被攝取，參與了膽固醇逆向轉(zhuǎn)運，具有抗動脈粥樣硬化作用[11]。本研究中不穩(wěn)定性心絞痛患者載脂蛋白均下調(diào)，說明脂代謝紊亂在其發(fā)病中起到重要的作用。

3.5 轉(zhuǎn)鐵蛋白11 kD、7 kD下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白是由肝臟合成的一類結(jié)合球蛋白，主要生理作用是維持體內(nèi)金屬離子穩(wěn)態(tài)，抑制LDL氧化修飾，從而減輕動脈硬化發(fā)生發(fā)展[12]。本研究中轉(zhuǎn)鐵蛋白下調(diào)，說明轉(zhuǎn)鐵蛋白在ACS發(fā)病中可能起到一定的作用。

3.6 轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白下調(diào)轉(zhuǎn)鐵蛋白是一種急性期負相蛋白，在機體內(nèi)起運輸營養(yǎng)物質(zhì)、激素和代謝物等作用，本研究中轉(zhuǎn)甲狀腺素蛋白下調(diào)，說明ACS發(fā)生時可能伴有代謝失常。

3.7 組成細胞骨架Gelsolin、凝溶膠蛋白-1亞基下調(diào)凝溶膠蛋白是組成細胞骨架蛋白的重要成分之一，屬于肌動蛋白結(jié)合蛋白，其主要功能是切割肌動蛋白（actin），介導細胞外骨架重排，和粥樣斑塊的纖維帽厚薄有關。本研究顯示ACS患者Gelsolin下調(diào)，運用ELISA的方法進一步驗證，說明急性冠脈綜合征時凝溶膠蛋白下調(diào)，纖維帽變薄，進一步促進其發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，本實驗采用血清蛋白質(zhì)組學技術分析了不穩(wěn)定性心絞痛發(fā)生發(fā)展過程中蛋白質(zhì)表達譜的變化，通過對差異蛋白的生物學功能分析，發(fā)現(xiàn)急性期反應蛋白、補體系統(tǒng)及凝血相關蛋白的異常，載脂蛋白、細胞骨架蛋白的降低，能量代謝紊亂等一系列的病理生理改變參與不穩(wěn)定性心絞痛的進展。發(fā)現(xiàn)了某些特異表達蛋白質(zhì)的改變，特別是細胞骨架蛋白，如凝溶膠蛋白的改變，尚未見相關報道，可能為心絞痛的防治提供新靶點，雖然進行了小樣本量的ELISA驗證，但尚需進一步實驗研究和大規(guī)模臨床驗證。