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        低溫堿性蛋白酶芽孢桿菌的篩選鑒定及酶學(xué)性質(zhì)研究

        2020-07-09 22:01:41石慧莫晨陽金喆昊
        糧食科技與經(jīng)濟(jì) 2020年1期

        石慧 莫晨陽 金喆昊

        [摘要]本研究從學(xué)院食堂附近的土樣、人工湖水樣和鯽魚、鯰魚的腸道中分離得到6株產(chǎn)蛋白酶菌株。經(jīng)搖瓶發(fā)酵復(fù)篩后,選擇產(chǎn)酶活高的菌株2、菌株5和菌株6進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、生理生化鑒定和部分酶學(xué)性質(zhì)研究。結(jié)果表明菌株2可能為短短芽孢桿菌,菌株5可能為蘇云金芽孢桿菌,菌株6可能為地衣芽孢桿菌。研究3株菌所產(chǎn)蛋白酶的最適pH,發(fā)現(xiàn)2號、5號和6號菌株的最適pH分別為6.0、8.0和10.0。菌株5和菌株6所產(chǎn)蛋白酶在pH為8.0~10.0的緩沖液中處理30min后活性幾乎不變,在堿性環(huán)境中均具有較好的穩(wěn)定性。菌株5和菌株6所產(chǎn)蛋白酶的最適反應(yīng)溫度均為30℃,低于30℃處理30min活性幾乎不變;50℃處理30min后,菌株5和菌株6的殘余酶活分別20%和40%。

        [關(guān)鍵詞]低溫堿性蛋白酶;芽孢桿菌;篩選;鑒定;酶學(xué)性質(zhì)

        中圖分類號:Q78;Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A DOI:10.16465/j.gste.cn431252ts.202001

        低溫堿性蛋白酶通常指在pH為堿性條件下,0℃~30℃內(nèi)催化效率較高,對熱相對不穩(wěn)定的一類蛋白酶[1]。低溫堿性蛋白酶主要由嗜低溫菌和耐低溫菌產(chǎn)生[2],包括假單胞桿菌屬、芽孢桿菌屬和黃桿菌屬等[3]。多數(shù)微生物的堿性蛋白酶還具有水解酯鍵、酰胺鍵、轉(zhuǎn)酯和轉(zhuǎn)肽的能力,因此被用于植物蛋白加工行業(yè),特別是用于大豆蛋白的降解,增加其營養(yǎng)效價[4-5]。目前,食品、水產(chǎn)飼料、洗滌劑行業(yè)和化妝品行業(yè)所用的蛋白酶主要是中溫堿性蛋白酶,其最適作用溫度通常為50℃~70℃。而這些產(chǎn)品的使用溫度在發(fā)展中國家通常在40℃以下,低溫堿性蛋白酶在這些產(chǎn)品中替代中溫堿性蛋白酶具有巨大的優(yōu)越性[6-8],具有廣闊的應(yīng)用前景。本研究篩選的幾株低溫堿性蛋白酶芽孢桿菌均具有較強的酶活,具有一定研究價值。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        樣品來源:武漢設(shè)計工程學(xué)院食堂后土樣、武漢設(shè)計工程學(xué)院人工湖水樣、鯽魚腸道、鯰魚腸道。

        初篩培養(yǎng)基:干酪素4.0g,KH2PO4 0.36g,Na2HPO4·7H2O 1.07g, NaCl 0.16g,CaCl2·2H2O 0.002g,MgSO4·7H2O 0.05g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.002g,胰蛋白胨0.05g,瓊脂20g,蒸餾水1 000mL,調(diào)節(jié)pH至7.0~7.2。

        發(fā)酵培養(yǎng)基:蛋白胨0.5%,干酪素0.8%,酵母膏0.1%,葡萄糖0.1%,氯化鈉0.58%,檸檬酸三鈉0.45%,瓊脂2%,pH為8.0。

        1.2 方法

        1.2.1 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的初篩

        稱樣品10g稀釋至10-5,取0.1mL 10-5稀釋液涂布在初篩培養(yǎng)基平板上,30℃恒溫培養(yǎng)36h后,觀察長出的菌落周圍酪蛋白水解圈產(chǎn)生的情況,挑取酪蛋白水解圈較大的菌落,劃線分離純培養(yǎng)并保存。

        1.2.2 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌初酶液的制備

        將篩選的細(xì)菌以5%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中,180r/min,28℃搖瓶培養(yǎng)36h,8 000r/min離心20min,取上清液,用細(xì)菌過濾器過濾除去殘余的菌體,獲得各菌株發(fā)酵液的無菌上清液即為粗酶液。

        1.2.3 堿性蛋白酶活力的測定

        堿性蛋白酶活的測定方法參考陳琳[7]的《產(chǎn)低溫蛋白酶菌株Halomonassp.SD-02的分離鑒定及其酶的提純與特性研究》,酶活力單位定義參照《酶制劑工業(yè)》[9]。

        1.2.4 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的復(fù)篩

        用1.2.2中方法制備粗酶液,1.2.3法測定各菌株粗酶液的堿性蛋白酶活力,粗酶液和酪蛋白均用0.1 M Na2CO3/NaHCO3(pH=10.0)緩沖液稀釋或溶解。選擇堿性蛋白酶活力相對高的菌株為供試菌株。

        1.2.5 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的鑒定

        1.2.5.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的形態(tài)鑒定

        10×100放大倍數(shù)下觀察用堿性復(fù)紅染色的菌株的形態(tài)、大小、芽孢的著生位置等并拍照;觀察菌株在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)并拍照。

        1.2.5.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的生理生化鑒定

        各菌株的生理生化鑒定項目見表2。

        1.2.6 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用pH的測定

        將1.2.3中酶促反應(yīng)的pH分別用檸檬酸鹽/磷酸、磷酸緩沖液、碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,測定各菌株的粗酶液在不同酶促反應(yīng)pH中的蛋白酶活力。

        1.2.7 各菌株所產(chǎn)的堿性蛋白酶對pH的穩(wěn)定性測定

        將各菌株的粗酶液分別用乙酸/乙酸鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,用碳酸鈉/碳酸氫鈉緩沖液調(diào)節(jié)pH至9.0、10.0、11.0、12.0處理30min,用福林酚試劑法測定各粗酶液的堿性蛋白酶活力。

        1.2.8 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用溫度的測定

        將1.2.3中酶促反應(yīng)的水浴溫度分別設(shè)定為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃,測定各菌株的粗酶液在不同酶促反應(yīng)溫度中的堿性蛋白酶活力。

        1.2.9 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性測定

        將各菌株的粗酶液分別在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃、60℃ 、70℃水浴30min,用福林酚試劑法測定其堿性蛋白酶活。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的篩選結(jié)果與分析

        2.1.1 產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的初篩結(jié)果與分析

        產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌在初篩平板上28℃恒溫培養(yǎng)36h后,不同菌落產(chǎn)生酪蛋白水解圈大小不同,選取水解圈大的菌落共計6株,見圖1。

        2.1.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的復(fù)篩結(jié)果與分析

        測定6株產(chǎn)蛋白酶細(xì)菌的(pH=10.0)堿性蛋白酶活,結(jié)果見表1。

        由表1可知,菌株2、菌株5和菌株6粗酶液的堿性蛋白酶活力相對較高,鑒定這3個菌株。

        2.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的鑒定結(jié)果

        2.2.1 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的形態(tài)鑒定結(jié)果

        鏡檢菌株2、菌株5和菌株6的個體形態(tài)特征圖片及這3株細(xì)菌的劃線分離純培養(yǎng)單菌落圖片見圖2。

        結(jié)果顯示,這33株菌株個體形態(tài)及菌落形態(tài)都有明顯的差異,為不同的菌種。

        它們鏡檢都能看到芽孢。菌株2菌落呈黃色,透明,濕潤,邊緣規(guī)則;菌株5菌體在顯微鏡下常成鏈狀排列,菌落呈乳白色,不透明,濕潤;菌株6芽孢與菌株5類似,菌體更短小,細(xì)胞間排列無規(guī)則,菌落前期濕潤透明,后期干燥、多褶皺,中間和邊緣凹陷。

        2.2.2 產(chǎn)堿性蛋白酶細(xì)菌的生理生化鑒定結(jié)果與分析

        菌株2、菌株5和菌株6生理生化指標(biāo)鑒定結(jié)果見表2。

        結(jié)合這3個菌株的形態(tài)及生理生化鑒定的試驗結(jié)果,對照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊》和《常用細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》,推測菌株2可能為類短芽孢桿菌屬中的短短芽孢桿菌,菌株5可能為芽孢桿菌屬蘇云金芽孢桿菌,菌株6可能為芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌。

        2.3 菌株所產(chǎn)的堿性蛋白酶的部分性質(zhì)測定結(jié)果

        2.3.1 菌株所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH 結(jié)果與分析

        見圖3可知,當(dāng)只改變蛋白酶酶活測定pH時,菌株2所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為6.0,其所產(chǎn)蛋白酶在pH 7.0~10.0酶活大幅下降,pH為11.0時,酶完全失活;菌株5所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為8.0,pH 9.0~10.0酶活小幅下降,pH為11.0時,酶完全失活;菌株6所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為10.0,pH為11.0時,酶活開始急劇下降。鑒于菌株2實際產(chǎn)酸性蛋白酶,只是在堿性pH范圍蛋白酶有一定的耐受性,在之后的研究中剔除菌株2。

        2.3.2 各菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的最適作用溫度結(jié)果與分析

        由圖4可知,菌株5的蛋白酶的最適作用溫度為30℃,在25℃~35℃蛋白酶活力小幅下降,在50℃完全失活;菌株6的蛋白酶的最適作用溫度為30℃,在35℃~50℃蛋白酶活力小幅下降。

        2.3.3 菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶對pH的穩(wěn)定性測定結(jié)果與分析

        菌株5產(chǎn)蛋白酶在pH 7.0~9.0較穩(wěn)定,酶活力波動不大,接近最高酶活,在pH 3.0~4.0及pH 11.0時,酶完全失活;菌株6所產(chǎn)蛋白酶pH8.0~10.0較穩(wěn)定,酶活力波動不大,pH接近10.0時酶活最高,在pH 3.0~4.0時,酶完全失活;pH為11.0時,酶活急劇下降(見圖5)。

        2.3.4 各菌株所產(chǎn)堿性蛋白酶的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果與分析

        菌株5和菌株6所產(chǎn)蛋白酶在20℃~30℃均較穩(wěn)定,20℃~30℃處理30min酶活幾乎不變。當(dāng)溫度超過30℃,隨著溫度的升高,酶活逐步降低。50℃保溫30min后,菌株5的酶活降低到20%左右,菌株6的酶活降低到40%左右,可見兩株菌所產(chǎn)蛋白酶的熱穩(wěn)定性均較差,菌株6略好于菌株5(見圖6)。

        3 結(jié) 論

        本實驗篩選出3株產(chǎn)蛋白酶的芽孢桿菌,菌株2為短短芽孢桿菌,菌株5為蘇云金芽孢桿菌,菌株6為地衣芽孢桿菌。其中菌株2所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為6.0,為酸性蛋白酶產(chǎn)生菌。菌株5所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為8.0;菌株6所產(chǎn)蛋白酶的最適作用pH為10.0,均為堿性蛋白酶產(chǎn)生菌株。

        菌株5所產(chǎn)蛋白酶的最適作用溫度為30℃,在25℃~35℃蛋白酶活力小幅下降,在50℃完全失活;菌株6的蛋白酶的最適作用溫度為30℃,在35℃~50℃蛋白酶活力小幅下降。

        參考文獻(xiàn)

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