胡 耕，劉 梟，舒鵬程，彭小忠,2*

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 生物化學(xué)與分子生物學(xué)系 醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類研究中心 神經(jīng)科學(xué)中心, 北京 100005; 2.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118)

突觸結(jié)構(gòu)是神經(jīng)元之間在功能上發(fā)生聯(lián)系的最小功能單位，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)信息傳遞的關(guān)鍵部位。突觸的結(jié)構(gòu)和功能會(huì)隨著自身活動(dòng)的加強(qiáng)與減弱發(fā)生較為持久的改變，該過程被稱為突觸的可塑性。神經(jīng)元樹突棘被認(rèn)為是突觸可塑性所必需的細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)。樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能由多種分子組成的復(fù)雜信號(hào)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控[1]，其中處于中心地位的是鈣離子(Ca2+)及其下游大量信號(hào)分子介導(dǎo)的生化反應(yīng)。樹突棘接受信號(hào)輸入時(shí)會(huì)產(chǎn)生大量Ca2+內(nèi)流[2]，隨后CaMKII作為繼電器將信號(hào)傳遞到RhoA、Rac1、H-Ras、CDC42等小GTP酶，小GTP酶激活可導(dǎo)致肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白的激活，從而發(fā)生新棘突的聚合和舊肌動(dòng)蛋白的解聚, 致使樹突棘形態(tài)及數(shù)量發(fā)生動(dòng)態(tài)改變[3]。

在影響突觸形成的諸多蛋白中，有一類為nectin-like molecules(NECLs)，它們是免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域的免疫球蛋白超家族成員。NECLs蛋白家族中的NECL2(nectin-like molecule-2)可以調(diào)節(jié)突觸數(shù)量和可塑性，并影響神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)[4]。NECL4在腦組織中表達(dá)廣泛，在外周神經(jīng)系統(tǒng)中，表達(dá)在施萬細(xì)胞(Schwann’s cell)上的NECL4與在背根節(jié)(dorsal root ganglion, DRG)神經(jīng)元表達(dá)的Necl1之間的相互作用有助于髓鞘的形成[5]。但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中NECL4的功能尚不明確，本文將通過一系列實(shí)驗(yàn)對(duì)NECL4在樹突棘形態(tài)和數(shù)量中的作用進(jìn)行研究，進(jìn)而探討NECL4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:高爾基染色實(shí)驗(yàn)小鼠分為兩組，實(shí)驗(yàn)組為Necl4全身性敲除(KO)小鼠[6](3)，對(duì)照組為Necl4野生型(WT)小鼠(3)，對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的小鼠為同窩小鼠。所有小鼠飼養(yǎng)在以12 h黑暗/照明為循環(huán)的無特定病原體環(huán)境中。所有動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)均已獲得中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院動(dòng)物保護(hù)與利用委員會(huì)的批準(zhǔn)，所有程序均在符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物法規(guī)(中國(guó)科學(xué)技術(shù)技術(shù)委員會(huì)第2號(hào)令)下進(jìn)行。

1.1.2 主要試劑: 高爾基染色試劑盒(FD Neuro Technologies公司)；CDC42抗體(Santa Cruz公司)；CaMKIIα、Phospho-CaMKIIα抗體、ERK1/2、Phospho-ERK1/2(Cell Signal Technology公司)；辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔源IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的小鼠來源IgG(北京中杉金橋生物公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京全式金生物技術(shù)公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)；引物合成(北京擎科生物技術(shù)公司)。

1.2 方法

1.2.1 Golgi-Cox染色及樹突棘密度的數(shù)量統(tǒng)計(jì):使用美國(guó)FD Neuro Technologies公司FD Rapid GolgiStainTMKit對(duì)Necl4野生型及敲除型小鼠全腦進(jìn)行Golgi染色。8周齡小鼠用0.7 %戊巴比妥鈉(0.1 mL/10 g體質(zhì)量)腹腔麻醉后，打開胸腔，剪開右心耳，經(jīng)左心室用0.1 mol/L(pH 7.4)PBS沖洗至流出液為無色。隨后小心分離端腦及小腦，確保組織完整。組織放入0.1 mol/L(pH 7.4)的PBS洗去表面血污后，放入等體積混勻的試劑A+試劑B中，浸泡6 h后更換等體積混勻的新鮮試劑A+試劑B。浸泡14 d 后，將組織轉(zhuǎn)移入試劑C中，4 ℃ 避光放置且第2天更換新鮮試劑C。4 ℃ 避光放置3 d后取出處理好的腦組織，使用振動(dòng)切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度200 μm，切好的腦片黏貼在載玻片上備用。向腦片上滴加ddH2O，5 min/次，共2次；隨后向腦片上滴加體積比為1∶1∶2的試劑D +試劑E +ddH2O的混合液，反應(yīng)10 min。向腦片滴加新鮮ddH2O以洗去反應(yīng)液，5 min/次，共2次。清洗后將切片進(jìn)行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片風(fēng)干并保存。

使用Nikon光學(xué)顯微鏡對(duì)腦片大腦皮質(zhì)第Ⅱ/Ⅲ層椎體神經(jīng)元二級(jí)樹突上樹突棘進(jìn)行Z軸掃描呈像，放大倍數(shù)1 000倍。使用Imaris 7.2.3對(duì)二級(jí)樹突進(jìn)行三維重構(gòu)，并對(duì)樹突棘密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.2.2 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá):提取8周齡小鼠的大腦皮質(zhì)蛋白，BCA法測(cè)定總蛋白濃度，CaMKIIα、phospho-CaMKIIα、ERK1/2、phospho-ERK1/2稀釋倍數(shù)均為1∶1 000，CDC42抗體稀釋倍數(shù)為1∶200，辣根過氧化物酶交聯(lián)的兔源IgG、辣根過氧化物酶交聯(lián)的鼠源IgG的稀釋倍數(shù)為1∶5 000。使用Quantity One 軟件進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白β-actin灰度值比值為各蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)mRNA水平:采用Trizol法提取8周齡小鼠的大腦皮質(zhì)總RNA，按照說明書使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。通過熒光定量PCR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)步驟如下，PCR反應(yīng)條件: 94 ℃條件下，預(yù)變性5 min，后進(jìn)行40次循環(huán)(循環(huán)條件為94 ℃/30 s，60 ℃/30 s，72 ℃/30 s)，后在72 ℃的條件下延伸10 min，最后4 ℃冷卻。所用PCR引物序列如表1。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

2 結(jié)果

2.1 高爾基染色顯示Necl4敲除后二級(jí)樹突上樹突棘數(shù)量減少

對(duì)Necl4敲除小鼠及野生小鼠腦組織進(jìn)行高爾基染色。結(jié)果顯示，在4倍光鏡下，Necl4 KO小鼠的大腦皮質(zhì)切片與Necl4 WT小鼠的大腦皮質(zhì)切片相比無明顯變化(圖1A)；在1 000倍油鏡下可以看到Necl4敲除后小鼠大腦皮質(zhì)第Ⅱ/Ⅲ層錐體神經(jīng)元的二級(jí)樹突的樹突棘的數(shù)量(WT:n=7、KO:n=7)與野生型相比明顯減少(P<0.01)(圖1B，C)。

2.2 Necl4敲除后CaMKIIα及phospho-CaMKIIα蛋白在大腦皮質(zhì)表達(dá)下降

結(jié)果顯示Necl4 敲除后，CaMKIIα及phospho-CaMKIIα(Thr286)在小鼠大腦皮質(zhì)的蛋白表達(dá)量與野生型相比明顯下降(WT:n=3、KO:n=3)(P<0.05)(圖2)。

A.Golgi-Cox staining images of forebrain neurons fromNecl4 WT and KO mice brains(×40),scale bar=500 μm; B.Golgi-Cox staining images of secondary dendritic spines in the mice Ⅱ/Ⅲ cerebral cortex(×1 000), scale bar=50 μm; C.quantitative analysis of spine density;*P<0.01 compared with WT group

圖1Necl4野生及敲除小鼠高爾基顯色結(jié)果

Fig 1 Golgi coloration results ofNecl4 wild and knockout mice(WT:n=7,KO:n=7)

2.3 Necl4敲除后CDC42在大腦皮質(zhì)的表達(dá)下降

Western blot和熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)分別在蛋白(WT:n=3、KO:n=3)及mRNA(WT:n=9、KO:n=9)水平顯示Necl4敲除后CDC42在小鼠大腦皮質(zhì)的表達(dá)水平顯著下降(P<0.05)(圖3)。

2.4 Rac1、H-Ras、RhoA 3種小GTPase蛋白的mRNA水平在Necl4敲除后有下降的趨勢(shì)

熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Necl4敲除后，Rac1、H-Ras、RhoA 3種小GTPase蛋白的mRNA表達(dá)水平雖然有下降的趨勢(shì)，但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(WT:n=5、KO:n=5)(圖4)。

2.5 ERK及phospho-ERK在Necl4敲除后有升高的趨勢(shì)

Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Necl4敲除后，ERK1/2及phospho-ERK1/2有升高的趨勢(shì)，但其差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(WT:n=3、KO:n=3)(圖5)。

A～C.expression of CaMKIIα and Phospho-CaMKIIα in cerebral cortex and quantitative analysis; *P<0.05 compared with WT group

A.expression of CDC42 in cerebral cortex; B.quantitative analysis of CDC42 protein expression(WT:n=3，KO:n=3),*P<0.05 compared with WT group; C.quantitative analysis of CDC42 mRNA expression,*P<0.05 compared with WT group

圖3Necl4野生及敲除小鼠CDC42的蛋白及mRNA表達(dá)水平

Fig 3 Protein and mRNA expression of CDC42 in cerebral cortex(WT：n=9，KO：n=9)

A～C.quantitative analysis of Rac1, H-Ras and RhoA mRNA expression

A～C.expression of ERK1/2 and phosphop-ERK1/2 in cerebral cortex and quantitative analysis

3 討論

突觸的形成是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育所必需的，成熟大腦中突觸的動(dòng)態(tài)變化與學(xué)習(xí)記憶等認(rèn)知功能有關(guān)。樹突棘數(shù)量的改變也與突觸的動(dòng)態(tài)變化息息相關(guān)，樹突棘的結(jié)構(gòu)和功能受鈣離子和大量信號(hào)分子介導(dǎo)的生化反應(yīng)的調(diào)節(jié)。本研究證明Necl4敲除后小鼠大腦皮質(zhì)第Ⅱ/Ⅲ層錐體神經(jīng)元二級(jí)樹突的樹突棘數(shù)量與野生型相比明顯減少，這說明NECL4可以調(diào)節(jié)樹突棘的密度。樹突棘受到刺激后發(fā)生Ca2+內(nèi)流，Ca2+通過NMDAs進(jìn)入樹突棘后與鈣調(diào)素(CaM)結(jié)合，激活CaMKII。Ca2+-CaMKII信號(hào)級(jí)聯(lián)是LTP誘導(dǎo)所必需的第一反應(yīng)。H-Ras、RhoA、CDC42和Rac1是CaMKII的下游信號(hào)分子，它們都是參與肌動(dòng)蛋白聚合和解聚相關(guān)信號(hào)通路的小GTPase蛋白。Western blot及實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示，Necl4敲除后，與Ca信號(hào)通路相關(guān)的CaMKIIα、phospho-CaMKIIα、CDC42的表達(dá)降低，提示NECL4可能通過Ca2+-CaMKII-CDC42信號(hào)通路影響信號(hào)在樹突棘中的傳播，進(jìn)而影響突觸的可塑性，并對(duì)突觸形態(tài)產(chǎn)生影響。RhoA、H-Ras作為傳播信號(hào)分子，可以將樹突棘接收的信號(hào)向細(xì)胞核傳遞，以激活核內(nèi)的信號(hào)，這一信號(hào)傳遞是由ERK信號(hào)通路完成的[7]。RT-qPCR結(jié)果顯示Necl4敲除后RhoA、H-Ras出現(xiàn)降低的趨勢(shì)，Western blot結(jié)果顯示ERK1/2及phospho-ERK1/2出現(xiàn)增高的趨勢(shì)，這些結(jié)果說明Necl4敲除可能導(dǎo)致樹突棘的接收信號(hào)向下傳播紊亂，或許對(duì)突觸間的信號(hào)傳遞造成影響。

綜上所述，細(xì)胞黏附分子Necl4敲除后，Ca2+-CaMKII-CDC42信號(hào)通路表達(dá)紊亂進(jìn)而影響樹突棘的數(shù)量。本研究主要聚焦在NECL4對(duì)樹突棘形態(tài)的影響，但是神經(jīng)元二級(jí)樹突上樹突棘的數(shù)量減少是否會(huì)對(duì)突觸功能可塑性乃至個(gè)體行為產(chǎn)生影響尚不明確。此外，NECL4對(duì)神經(jīng)元或膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度的影響，及NECL4影響Ca2+內(nèi)流因素的調(diào)控機(jī)制也尚不知曉。因此，通過電生理、Western blot及免疫組化等技術(shù)檢測(cè)這些關(guān)鍵指標(biāo)將進(jìn)一步揭示NECL4在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中對(duì)鈣信號(hào)的調(diào)控作用。