馮春特, 黃伊嘉, 楊磊*, 莫開林*

1. 東北林業(yè)大學化學化工與資源利用學院，黑龍江 哈爾濱 150040；

2. 四川省林業(yè)科學研究院，四川 成都 610081

夏枯草（Prunella vulgaris L.）為唇形科夏枯草屬植物，是一種重要的多年生藥用植物，在全國各地均有分布，主產(chǎn)于四川、陜西、甘肅、江蘇、浙江、安徽、河南等省，國外主要分布在歐洲、北非、西亞、印度、北美洲等地[1]。夏枯草作為一種傳統(tǒng)的中藥，在中國有多年的使用歷史。傳統(tǒng)的中醫(yī)學理論認為夏枯草味道苦澀而且辣性冷，具有消腫、抗發(fā)熱和鎮(zhèn)靜的作用[2,3]?，F(xiàn)代臨床研究表明，夏枯草具有廣泛的生物學效應，包括抗病毒、抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性[4-7]。除藥用外，夏枯草也被應用于涼茶和食品中[8]。

研究表明，夏枯草中含有多種類型的化學成分，目前從中已分離出萜類、甾醇類、酚酸類、黃酮類、揮發(fā)油及糖類等多種化學成分[9]。迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（Rosmarinic acid-3-O-glucoside）作為夏枯草的特征成分[10,11]，已被人們廣泛研究。藥理學研究表明，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷都具有廣泛的生物活性，如抗氧化、抗菌、抗病毒和抗腫瘤等[12-14]。

超聲細胞破碎輔助提取是近些年來發(fā)展起來的新技術(shù)，擁有操作簡單，提取時間短和溶劑消耗少的特點，已經(jīng)成功應用于很多中藥植物活性成分的提取[15]。本實驗將超聲探頭直接接觸植物組織與提取溶劑，對夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的提取工藝進行研究，為中藥夏枯草資源的深度開發(fā)提供技術(shù)基礎。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

夏枯草購于安徽亳州市大西北藥業(yè)有限責任公司，經(jīng)東北林業(yè)大學谷會巖教授鑒定，用粉碎機粉碎，過60～80 目備用。

迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷（純度98%，成都瑞芬思生物科技有限公司），甲醇（色譜級，賽莫非世爾科技(中國)有限公司），乙醇（分析級，天津市天士力化學試劑有限公司）。

高效液相色譜儀（安捷倫Agilent 1260），超聲波細胞破碎儀（型號JY92-IID）。

1.2 實驗方法

1.2.1 HPLC 色譜條件及標準曲線的繪制

對迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷進行HPLC 定量分析，色譜條件為：Agilent 5 TC-C18 色譜柱(5 μm，4.6 mm × 250 mm)，檢測波長315 nm，柱溫25 ℃，進樣量10 μL，流速為1 mL·min-1；流動相體系為0.2 %磷酸-甲醇（60∶40），等度洗脫30 min。

按照上述色譜條件，配制系列濃度（0.1 mg·mL-1、0.2 mg·mL-1、 0.3 mg·mL-1、 0.4 mg·mL-1和0.5 mg·mL-1）的迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷對照品溶液，HPLC 檢測，線性擬合得到回歸方程分別為：

式中: x 為對照品的濃度(mg·mL-1)，Y 為峰面積

1.2.2 樣品中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷含量測定

稱取夏枯草粉末0.5g，于10 mL 50%乙醇中超聲提取10 min。過濾得粗提液。取粗提液2 mL 過0.45 μm 微孔濾膜，HPLC 檢測得目標產(chǎn)物峰面積，代入回歸方程得到產(chǎn)物濃度。產(chǎn)物得率計算公式為：

式中：Y 為產(chǎn) 物 的 率（mg·g-1）；c 為粗提 液 濃 度（mg·mL-1）；v 粗提液為體積（mL）；m 為夏枯草粉末質(zhì)量（g）

1.2.3 超聲輔助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷

根據(jù)迷迭香酸類物質(zhì)的穩(wěn)定性，實驗選取乙醇作為提取溶劑[16]。精確稱取夏枯草粉末0.5 g 于容器中，在不同條件下進行超聲輔助提取，計算得率。分別考察乙醇體積分數(shù)、液料比、空化時間、緩沖時間、超聲功率和提取時間對目標產(chǎn)物得率的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 乙醇體積分數(shù)的影響

準確稱取夏枯草粉末0.5 g，分別加入10 mL 不同體積分數(shù)的乙醇（0、10 %、20 %、30 %、40 %、50 %、60 %、70 %和80 %），空化時間1.5 s，緩沖時間2.0 s，超聲功率250 W，在此條件下超聲提取10 min。取濾液過0.45 μm 微孔濾膜，HPLC 檢測，計算得率。

乙醇體積分數(shù)對迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影響如圖1 所示，由圖可見，隨著乙醇體積分數(shù)的增加，目標產(chǎn)物迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率增長顯著，但當乙醇體積分數(shù)超50%時，產(chǎn)物的得率有下降趨勢，綜合考慮，選取體積分數(shù)50 %的乙醇作為最佳濃度。

圖1 乙醇體積分數(shù)的影響Fig. 1 Effect of ethanol concentration on yield

2.2 液料比的影響

選用50%的乙醇作為提取溶劑，選用不同的液料比（10、15、20、25 和30 mL·g-1），在250 W 功率下，空化1.5 s，緩沖2.0 s，超聲提取10 min。圖2顯示了不同液料比對產(chǎn)物得率的影響。由圖可知，隨著液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率呈遞增趨勢，這是由于溶劑用量的增加，物料與溶劑的接觸面積增加，有利于目標產(chǎn)物擴散速度的提高。當液料比在增長到25 mL·g-1時，隨著液料比的增加，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率變化不明顯，因此考慮不造成溶劑的浪費，我們選擇25 mL·g-1作為最佳液料比。

圖2 液料比的影響Fig. 2 Effect of liquid-solid ratio on yield

2.3 超聲時間的影響

選用50%的乙醇，25 mL·g-1的液料比，在250 W功率下考察不同超聲時間（1、3、5、7、9 和11 min）對目標產(chǎn)物得率的影響，結(jié)果如圖3 所示，7 min 之后隨著時間的增加，目標產(chǎn)物得率變化不顯著，推測可能是由于超聲探頭直接與提取溶劑與物料接觸，能夠更充分地破壞細胞壁使目標產(chǎn)物釋放，使其在較短的時間內(nèi)達到提取完全，因此為避免造成資源的浪費，我們選取提取時間7 min 作為最佳的超聲時間。

圖3 超聲時間的影響Fig. 3 Effect of ultrasonic irradiation time on yield

2.4 超聲功率的影響

提取溶劑為50%的乙醇，液料比為25 mL·g-1，在不同的超聲功率（150 W、200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W 和500 W）條件下空化1.5 s，緩沖2.0 s，提取7 min。目標產(chǎn)物得率隨功率變化的趨勢如圖4 所示，功率由150 W 增加到300 W 時，目標產(chǎn)物的得率有增加趨勢，300 W 之后隨著功率的增加，產(chǎn)物得率變化不顯著，推測可能是超聲探頭直接接觸物料，避免了超聲波在傳輸過程中能量的損耗，所以較低的功率就能夠充分破壞細胞壁，因此將300 W 作為最佳的超聲功率。

2.5 空化時間和緩沖時間的影響

在超聲功率300 W，超聲時間7 min，液料比25 mL·g-1，提取溶劑選用50%乙醇條件下，分別考察不同空化時間（0.5～3.5 s）、不同緩沖時間（0.5～3.5 s）對目標產(chǎn)物得率的影響。不同空化時間對產(chǎn)物得率的影響如圖5 所示，0.5 s 至1.5 s 目標產(chǎn)物得率有增加趨勢，1.5 s 之后，隨著空化時間的增加，目標產(chǎn)物的得率變化不顯著，考慮到能耗的因素，因此我們選擇空化時間1.5 s 作為最佳條件。

圖4 超聲功率的影響Fig. 4 Effect of ultrasonic irradiation power on yield

圖5 空化時間的影響Fig. 5 Effect of cavitation time on yield

圖6 顯示了不同緩沖時間對迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷得率的影響。如圖所示，緩沖時間在0.5～2.0 s時間范圍內(nèi)，迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率有增加趨勢，2.0 s 之后，隨著緩沖時間的增加，目標產(chǎn)物的得率有降低趨勢，推測可能是隨著緩沖時間增加，同一提取過程中空化時間減少，降低了目標產(chǎn)物向溶劑的擴散，從而導致得率的降低。因此，我們選擇2.0 s 作為最佳緩沖時間。

圖6 緩沖時間的影響Fig. 6 Effect of buffer time on yield

3 結(jié)論

實驗選用乙醇作為提取劑，通過單因素實驗得到超聲細胞破碎輔助提取夏枯草中迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的最佳提取工藝：乙醇體積分數(shù)50%，液料比25 mL·g-1，空化時間1.5 s，緩沖時間2.0 s，超聲功率300 W，提取時間7 min，在最佳條件下迷迭香酸-3-O-葡萄糖苷的得率為0.71 mg·g-1。超聲細胞破碎輔助提取在常溫下就可進行，具有提取效率高、時間短、綠色環(huán)保的優(yōu)點。