宋劍嬋，于秀杰，司婧文，劉易欣

1天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070；2天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院

卵巢上皮性腫瘤是常見的婦科腫瘤性疾病，其中卵巢癌的病死率居?jì)D科惡性腫瘤之首。卵巢癌患者的低生存率與其惡性浸潤轉(zhuǎn)移有關(guān)，而卵巢癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力的關(guān)鍵因素之一是腫瘤缺氧微環(huán)境[1]。缺氧誘導(dǎo)因子(HIFs)是一種蛋白質(zhì)，可促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，并對組織中含氧量的降低產(chǎn)生生理反應(yīng)，激活特定基因的表達(dá)[2]。其中HIF-1α是調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞適應(yīng)低氧的核心轉(zhuǎn)錄因子，為全局性調(diào)控缺氧應(yīng)答的因子，在腫瘤的能量代謝、血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要作用。此外，癌癥的轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟過程，開始于細(xì)胞的上皮—間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)，通常發(fā)生在腫瘤轉(zhuǎn)移的起始階段，發(fā)生EMT的上皮細(xì)胞在經(jīng)歷了短暫的結(jié)構(gòu)改變后，其細(xì)胞表型亦發(fā)生改變，E-鈣黏蛋白(E-cadherin)等上皮表型的特征性蛋白減少，而N-鈣黏蛋白(N-cadherin)等間質(zhì)細(xì)胞表型的特征性蛋白增多[3]。研究證實(shí)，腫瘤細(xì)胞內(nèi)部HIF-1α與EMT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)相互協(xié)同，HIF-1α能直接或間接地調(diào)控、誘導(dǎo)EMT相關(guān)基因的表達(dá)，并能調(diào)節(jié)各個(gè)因子間的相互作用，進(jìn)而促進(jìn)EMT形成[4]。2017年3月，我們探討了不同卵巢上皮性腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin和N-cadherin的表達(dá)變化及意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011年1～12月天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院原發(fā)卵巢上皮性腫瘤患者161例，且術(shù)前均未予以放、化療治療，其中良性腫瘤51例(漿液性腫瘤17例，黏液性腫瘤17例，宮內(nèi)膜樣腫瘤17例)，交界性腫瘤48例(漿液性腫瘤25例，黏液性腫瘤14例，漿黏液性腫瘤6例，宮內(nèi)膜樣腫瘤2例，透明細(xì)胞腫瘤1例；FIGO分期Ⅰ期44例，Ⅱ期3例，Ⅲ期1例，Ⅳ期0例)，惡性腫瘤62例，漿液性癌43例(低級別漿液性癌11例，高級別漿液性癌30例)，黏液性癌4例，宮內(nèi)膜樣癌5例，透明細(xì)胞癌12例，Kurman分型Ⅰ型癌29例(低級別漿液性癌11例，黏液性癌4例，低級別宮內(nèi)膜樣癌2例，透明細(xì)胞癌12例)，Ⅱ型癌33例(高級別漿液性癌30例，中、高級別宮內(nèi)膜樣癌3例)；FIGO分期Ⅰ期20例，Ⅱ期12例，Ⅲ期28例，Ⅳ期2例。

1.2 卵巢上皮性腫瘤組織中HIF-1α、E-cadherin及N-cadherin表達(dá)檢測 采用免疫組化SP染色法。石蠟切片脫蠟水化：環(huán)保脫蠟劑8 min×3→無水乙醇2 min×3→95%乙醇2 min→80%乙醇2 min→流水沖洗→蒸餾水洗5 min；PBS緩沖液沖洗，3 min×3；抗原修復(fù)：將1 000 mL抗原修復(fù)液置于高壓鍋內(nèi)加熱至煮沸，切片置于切片架上放入鍋中，液面要高于切片，高溫高壓修復(fù)3 min，自然冷卻至室溫；PBS緩沖液沖洗，3 min×3；3%H2O2溶液室溫避光孵育10 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS緩沖液沖洗，3 min×3；滴加一抗[一抗鼠抗人HIF-1α(ESEE122)單抗?jié)饪s液購于美國Novus Biological公司，工作濃度1∶1 200；一抗鼠抗人E-cadherin和鼠抗人N-cadherin均為單抗工作液，購于北京中杉金橋公司]，切片水平置于濕盒中，恒溫箱37 ℃孵育1 h；PBS緩沖液沖洗，3 min×3；滴加二抗，切片水平置于濕盒中，恒溫箱37 ℃孵育30 h；PBS緩沖液沖洗，3 min×3；DAB顯色：統(tǒng)一時(shí)間滴加新配制的DAB工作液，顯微鏡下觀察，當(dāng)目標(biāo)部位出現(xiàn)棕黃色顆粒時(shí)，統(tǒng)一時(shí)間于自來水中沖洗，終止顯色；充分水洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核，分色、返藍(lán)，流水沖洗；脫水透明：80%乙醇2 min→95%乙醇2 min→無水乙醇2 min×3→環(huán)保脫蠟劑2 min×3；中性樹膠封片。檢測系統(tǒng)為美國DAKO公司的抗兔/鼠通用型試劑盒(EnVisionTM+加強(qiáng)型)，包括：A瓶：ChemMateTMEnVision+/HRP(兔/小鼠)；B瓶：DAB 緩沖稀釋液；C瓶：DAB原液。HIF-1α以胎盤作為陽性對照，E-cadherin以乳腺浸潤性導(dǎo)管癌作為陽性對照，N-cadherin以心肌作為陽性對照，以磷酸鹽緩沖液 (PBS) 代替一抗作為陰性對照，每例切片均常規(guī)進(jìn)行蘇木素-伊紅染色。

1.3 結(jié)果判定 HIF-1α以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒視為陽性表達(dá)，先按染色強(qiáng)度，無色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分；再按陽性細(xì)胞所占百分比，陽性細(xì)胞數(shù)≤5%為0分，6%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥75%為4分；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積:<2為陰性表達(dá)，≥2為陽性表達(dá)[5]。

E-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，染色陰性或陽性率≤10%為0分；弱陽性表達(dá)且陽性率≥10%為1分；中等強(qiáng)度陽性表達(dá)且陽性率≥10%為2分；與正常組織表達(dá)強(qiáng)度相同視為強(qiáng)陽性表達(dá)，且陽性率≥10%為3分；0分、1分和2分為低表達(dá)，3分為正常表達(dá)[5]。

N-cadherin主要表達(dá)于細(xì)胞膜上，先按染色強(qiáng)度，無色0分，弱陽性1分，中等強(qiáng)度陽性2分，強(qiáng)陽性3分；再按陽性細(xì)胞所占百分比，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，≥51%為3分；染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞百分比的乘積:0分(-)～1分(+)為正常表達(dá)，2～4分(++)及6～9分(+++)為過表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SAS9.4統(tǒng)計(jì)軟件。定性資料采用“例數(shù)(百分比)”表示，數(shù)據(jù)比較采用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)、Wilcoxon秩和檢驗(yàn)、Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。HIF-1α表達(dá)與E-cadherin表達(dá)的關(guān)系采用Fisher精確檢驗(yàn)，HIF-1α表達(dá)N-cadherin表達(dá)的關(guān)系采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α表達(dá)與腫瘤性質(zhì)、組織分化程度及FIGO分期的關(guān)系 HIF-1α表達(dá)在良性、交界性、惡性腫瘤中逐漸增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.000 1)；HIF-1α表達(dá)與卵巢癌組織分化程度有關(guān)，即分化越差的卵巢癌，HIF-1α評分越高(P=0.004 1)；HIF-1α表達(dá)與卵巢腫瘤分期有關(guān)(P=0.000 3)，分期越高，HIF-1α表達(dá)評分越高，見表1。

表1 HIF-1α表達(dá)與腫瘤性質(zhì)、組織分化程度及FIGO分期的關(guān)系[例(%)]

2.2 E-cadherin表達(dá)與腫瘤性質(zhì)、組織分化程度及FIGO分期的關(guān)系 E-cadherin表達(dá)隨著腫瘤惡性程度增加逐漸下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；E-cadherin在卵巢癌中均呈低表達(dá)，不同分化程度的卵巢癌間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，E-cadherin表達(dá)與卵巢腫瘤分期無關(guān)(P=1.000)，見表2。

表2 E-cadherin表達(dá)與腫瘤性質(zhì)、組織分化程度及FIGO分期的關(guān)系[例(%)]

2.3 N-cadherin表達(dá)與腫瘤性質(zhì)、組織分化程度及FIGO分期的關(guān)系 N-cadherin表達(dá)在良性、交界、惡性腫瘤中呈遞增趨勢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)；在卵巢癌中N-cadherin蛋白均呈高表達(dá)，但不同組織分化程度的卵巢癌間表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.594)；N-cadherin表達(dá)與卵巢腫瘤分期有關(guān)(P=0.020)。FIGO分期越高，N-cadherin表達(dá)陽性程度越高，見表3。

2.4 HIF-1α與E-cadherin、N-cadherin表達(dá)的關(guān)系 HIF-1α評分<2分時(shí)，E-cadherin低表達(dá)率為51.72%(30/58),正常表達(dá)率為48.28%(28/58)；HIF-1α評分≥2分時(shí)，E-cadherin低表達(dá)率為76.70%(79/103),正常表達(dá)率為23.30%(24/103)，HIF-1α評分與E-cadherin表達(dá)有關(guān)(P=0.001 6)。HIF-1α評分<2分時(shí)，N-cadherin表達(dá)+者占比41.38%(24/58),++者占比29.31%(17/58)，+++者占比29.31%(17/58)；HIF-1α評分≥2分時(shí)，N-cadherin表達(dá)+者占比23.30%(24/103),++者占比24.27%(25/103)，+++者占比52.43%(54/103)；HIF-1α評分與N-cadherin表達(dá)有關(guān)(χ2=8.925 1，P= 0.011 5)。

3 討論

HIF-1是由α和β兩個(gè)亞單位組成的異二聚體蛋白，α亞單位是HIF-1的功能單位，決定HIF-1的活性[6]。研究證明，HIF-1α在缺氧條件下的轉(zhuǎn)錄過程中具有核心作用。常氧條件下HIF-1α迅速被降解而維持在較低水平，缺氧條件下其降解受到抑制從而穩(wěn)定存在，并與HIF-1β形成有活性的HIF-1二聚體DNA結(jié)合蛋白，調(diào)節(jié)下游的基因轉(zhuǎn)錄。HIF-1α在卵巢惡性腫瘤中的過表達(dá)已得到公認(rèn)[7]，但其在卵巢交界性腫瘤中的表達(dá)及HIF-1α與腫瘤的組織學(xué)分級和分期的關(guān)系尚不明確。本研究結(jié)果顯示，HIF-1α表達(dá)與卵巢良性腫瘤、交界性腫瘤、惡性腫瘤中的陽性表達(dá)呈增高趨勢，HIF-1α與腫瘤的組織學(xué)分化程度有關(guān)，高分化腫瘤較低分化腫瘤的HIF-1α陽性率和陽性指數(shù)更高，且腫瘤分期越高，HIF-1α表達(dá)評分越高。

E-cadherin是一種鈣依賴性跨膜糖蛋白，位于染色體的16q22.1，是鈣黏蛋白分子家族的成員之一，能調(diào)節(jié)細(xì)胞間的相互作用[8]。E-cadherin定位于細(xì)胞與細(xì)胞的邊界處，強(qiáng)烈表達(dá)于黏附連接中，從而維持上皮細(xì)胞的完整性和極性。E-cadherin缺失或表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致上皮細(xì)胞失去細(xì)胞間的黏附，并獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，具有更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[9]，這一過程被稱為EMT。研究表明，EMT不僅在胚胎發(fā)育過程中，而且在癌癥進(jìn)展等病理?xiàng)l件下有關(guān)鍵性作用。至今諸多研究證實(shí)，E-cadherin失表達(dá)與卵巢癌晚期的腫瘤進(jìn)展和預(yù)后不良密切相關(guān)，其機(jī)制可能是E-cadherin基因突變、E-cadherin啟動(dòng)子高甲基化、RNA轉(zhuǎn)錄抑制或基質(zhì)酶活化[10]。然而對E-cadherin低表達(dá)與卵巢癌組織學(xué)分級的關(guān)系目前尚存在爭議，部分研究認(rèn)為，E-cadherin低表達(dá)與卵巢癌高組織學(xué)分級和子宮肌層深部浸潤有關(guān)，而另有部分研究提出了相反的結(jié)論。本研究結(jié)果顯示，E-cadherin表達(dá)均與卵巢上皮性腫瘤性質(zhì)相關(guān)，E-cadherin低表達(dá)率在良性腫瘤、交界性腫瘤、惡性腫瘤中逐漸上升；而E-cadheri表達(dá)與腫瘤的組織分化程度和FIGO分期無關(guān)。

N-cadherin是一種間質(zhì)標(biāo)志物，與E-cadherin同屬鈣黏蛋白家族六個(gè)基因家族中的經(jīng)典鈣黏蛋白Ⅰ型，是一種更具移動(dòng)性和侵襲性的表型[11]。生理?xiàng)l件下，N-cadherin表達(dá)于神經(jīng)、肌肉和造血等神經(jīng)外胚層及中胚層來源的組織，而正常上皮組織通常不表達(dá)。“鈣黏蛋白轉(zhuǎn)換”現(xiàn)象是卵巢上皮性腫瘤EMT過程的關(guān)鍵特征，即E-cadherin表達(dá)下調(diào)的同時(shí)N-cadherin表達(dá)上調(diào)?，F(xiàn)已證實(shí)，乳腺癌、前列腺癌、尿路上皮癌和胰腺癌等上皮性癌均與N-cadherin表達(dá)上調(diào)有關(guān)[12]，雖然其表達(dá)不被認(rèn)為是致癌的，也不被認(rèn)為是實(shí)體腫瘤生長的啟動(dòng)子[13]，但實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，N-cadherin可驅(qū)使腫瘤細(xì)胞向周圍細(xì)胞間質(zhì)遷移，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[14]。然而，目前關(guān)于N-cadherin在實(shí)體腫瘤中的預(yù)后價(jià)值仍存有爭議。我們的研究結(jié)果顯示，隨著腫瘤惡性程度則增加，N-cadherin的表達(dá)逐漸增高，且FIGO分期越高，N-cadherin過表達(dá)越高，這說明N-cadherin在卵巢上皮性惡性腫瘤的疾病進(jìn)展中可能發(fā)揮了一定作用，其作用依據(jù)有待進(jìn)一步研究。此外，本研究結(jié)果表明，HIF-1α表達(dá)陽性時(shí)，E-cadherin低表達(dá)增強(qiáng)，與此同時(shí)N-cadherin過表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步證實(shí)在卵巢上皮性腫瘤中的發(fā)展中，缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)了EMT的發(fā)生。

綜上所述，在卵巢癌中，E-cadherin呈低表達(dá)，N-cadherin、HIF-1α呈高表達(dá)，HIF-1α與N-cadherin促進(jìn)卵巢癌的浸潤和轉(zhuǎn)移，HIF-1α促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的分化，三者共同促進(jìn)卵巢上皮性腫瘤的發(fā)展。