馬曉麗

（晉中學院生物科學與技術學院，山西晉中030619）

白菜，二年生草本植物，屬十字花科蕓苔屬，通常株高40～60cm，在全國范圍內(nèi)都有栽培，但北方較南方的栽培區(qū)域和栽培量多，是廣為人們喜食的綠色蔬菜，也是經(jīng)常食用的最大眾化的食物之一．氣體信號分子一氧化氮（Nitric oxide，NO），最早引起人們的關注是在研究人體和動物的過程中，之后在植物界的研究也逐漸被重視起來．現(xiàn)有研究表明，一氧化氮在植物的生長和發(fā)育中具有調(diào)節(jié)作用，可以起到迫害和保護細胞的雙重作用，同時對植物其他方面也起著非常重要的調(diào)節(jié)作用［1～5］，如萌發(fā)種子、發(fā)育幼苗、葉子的生長、抗逆性等．植物內(nèi)NO的合成主要有兩個途徑：一是酶促反應，即在一氧化氮合酶（Nitric oxide synthase，NOS）、硝酸還原酶（Nitrate reductase，NR）及亞硝酸還原酶（Nitrite reductase，NiR）等酶類的相互作用下生成［6］；二是非酶促反應，由底物直接分解生成［7～10］．本試驗中外源一氧化氮供體是硝普鈉（Sodium Nitroprusside，SNP），SNP分子進入植物體內(nèi)會在細胞中先形成NO-，并且使逐步形成的一氧化氮氣體得到釋放，最終在植物體內(nèi)發(fā)生作用［11～12］．通過幼苗培養(yǎng)試驗法對其進行研究，先用水培法萌發(fā)白菜種子，然后用營養(yǎng)液對幼苗進行培養(yǎng)，噴施不同濃度的硝普鈉溶液，觀察對白菜生長發(fā)育的影響，包括幼苗的株高、莖粗、葉片數(shù)、花芽分化率、抽苔期、開花期以及對白菜幼苗中葉綠素、可溶性糖和蛋白質(zhì)等方面含量的影響，從而指導農(nóng)業(yè)生產(chǎn)．

1 材料與方法

1.1 材料、儀器、試劑

試驗材料：津玉11號白菜（Bassica rapa L ssp.pekinensis）由山西省農(nóng)業(yè)科學院提供．

試驗儀器：FA1104型號電子天平（上天牌）、SPX-15085H生化培養(yǎng)箱（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、培養(yǎng)皿、EU-2600R型號紫外分光光度計（上海昂拉儀器有限公司）、DL-6000B型號高速離心機（飛鴿牌）等儀器．

試驗試劑：硝普鈉（［Na2Fe（CN）5］NO，SNP，Sigma 公司）提供 NO，4℃避光保存，現(xiàn)配 200 μmol/L 的母液，再按所需濃度稀釋現(xiàn)用．

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設計

試驗在晉中學院組培間進行．選取籽粒飽滿，大小均勻的白菜種子，經(jīng)0.1%KMnO4表面消毒后，蒸餾水沖洗干凈，培養(yǎng)于盛有濕濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，20粒/盤，23℃催芽．種子露白時，轉(zhuǎn)移至光照培養(yǎng)室（生長條件光照16 h/d，光通量密度400 μmol/（m·s）），23℃培養(yǎng)，相對濕度60%，每3 d澆灌1次1/2 Hoagland營養(yǎng)液．生長20 d后，挑選長勢基本一致的幼苗洗凈轉(zhuǎn)入育苗缽中預培養(yǎng)，待白菜幼苗長出兩片真葉時開始處理．試驗設置 6 個處理組：（1）CK 組（水+1/2 Hoagland）；（2）100 SNP（水+1/2 Hoagland+100 μmol/LSNP）；（3）200 SNP（水+1/2 Hoagland+200 μmol/L SNP）；（4）300 SNP（水+1/2 Hoagland+300 μmol/L SNP）；（5）400 SNP（水+1/2 Hoagland+400 μmol/LSNP）；（6）500SNP（水+1/2 Hoagland+500 μmol/LSNP）．與開花相關的指標分化率、抽苔和開花期的測定，采用四個較低濃度（50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L）SNP來處理．處理方法同上．各處理重復3次，為保證處理濃度穩(wěn)定，每隔2d更換一次處理液，間歇通入空氣．處理7次后，取相同節(jié)位的葉片用于分析測定．

1.2.2 相關指標測定方法

（1）株高測量.取不同處理長勢一致的20株白菜幼苗，用直尺測量幼苗株高．

（2）莖粗測量.取不同處理長勢一致的20株白菜幼苗，用直尺測量幼苗莖粗．

（3）葉片數(shù)統(tǒng)計.是指抽苔之前從定植開始生長的簇生葉片數(shù)．

（4）花芽分化率統(tǒng)計.參照侯金星［13］等人的記載方法．花芽分化時期是指從子葉生長到平展，再到花芽分化開始的過程，即按花芽分化形態(tài)觀察的分級標準進行觀察.現(xiàn)蕾時期：把心葉剝開一到兩片后，用眼睛可以看到的一種黃綠色的花蕾，將這一時期規(guī)定為此植株始顯蕾.抽苔時期：將花苔伸長到于菜口平齊作為參考標準．

花芽分化級數(shù)參照王真真［14］等人的方法將營養(yǎng)生長期（0級）之后的花芽發(fā)育分為6級．

1）第0級：表示生長點處在營養(yǎng)生長狀態(tài)，直徑小于200μm.

2）第1級：生長點開始膨大，卻仍處在營養(yǎng)生長狀態(tài)，并且直徑達到200μm以上.

3）第2級：生長點會繼續(xù)膨大，在中心圓突起周圍會有3～5個小圓突起圍繞，我們把這些突起叫做花原基，此時周圍的葉原基分化停止，將這一級定為植物從營養(yǎng)生長向生殖生長轉(zhuǎn)變的一個標志.

4）第3級：周圍的圓突起會接著增加，形成一個圓突群，也就是短棒狀的花柄.

5）第4級：周圍的圓突群繼續(xù)分化成花蕾的雛形，而且花柄也開始伸長.

6）第5級：在花柄繼續(xù)伸長后，側芽開始分化的同時花萼也開始分化.

7）第6級：一般是指花瓣原基分化期和雌蕊原基分化期．我們把顯蕾、抽苔均劃分為6級［15］．

花芽分化指數(shù)計算公式：花芽分化指數(shù)=（∑級數(shù)×株數(shù)）/（最高級數(shù)×總株數(shù)）×100．

5）抽苔所需天數(shù)統(tǒng)計.從種子萌發(fā)開始到苔頂部到基部長度大于等于5cm時所需要天數(shù)；初始花所需天數(shù)統(tǒng)計，從種子萌發(fā)開始到植株第一朵花的開放所需要的天數(shù)．

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

本研究在關于大白菜生長發(fā)育和花期相關指標的統(tǒng)計分析試驗中，每一試驗都進行三次生物學重復．采用SPSS19.0軟件使用單因素方差分析對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，不同字母代表樣本間的顯著性差異，p＜0.05和p＜0.01分別表示顯著差異和極顯著差異．

2 結果與分析

2.1 不同濃度一氧化氮供體SNP處理對白菜幼苗生長發(fā)育的影響

由表1可知，經(jīng)100μmol/L SNP處理后白菜幼苗的增長最為顯著，200μmol/L SNP與對照組的差異不顯著．高于300μmol/L SNP處理后，白菜幼苗反而會呈現(xiàn)植株萎蔫，葉片脫落，莖干變細等現(xiàn)象．說明用低濃度的一氧化氮供體SNP處理后，可以有效地促進白菜幼苗的生長；當一氧化氮供體SNP的濃度超過一定閾值后就會對白菜幼苗的生長產(chǎn)生不利的影響．

表1 不同濃度一氧化氮對白菜幼苗生長發(fā)育的影響

2.2 不同濃度一氧化氮供體SNP處理對白菜幼苗葉綠素含量的影響

通過分光光度法對白菜幼苗葉子的葉綠素含量進行測定，將葉綠素的提取液分別置于645nm、663nm波長處對其進行吸光度的測定，再根據(jù)Arnon法進行葉綠素相關量的計算，結果如表2．從總體看來，NO供體SNP處理后的白菜幼苗葉綠素含量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，100 μmol/L SNP處理的白菜幼苗葉綠素的含量比對照組的要增高29.45%；200 μmol/L SNP處理的白菜幼苗的葉綠素含量比對照組的要增高11.74%；而300 μmol/L SNP處理的白菜幼苗的葉綠素含量與對照組相比差異不顯著．

表2 不同濃度一氧化氮對白菜幼苗葉綠素含量的影響

2.3 不同濃度一氧化氮供體SNP處理對白菜幼苗可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響

由表3可知，對白菜幼苗進行一氧化氮處理后，不僅可以增加白菜植株體內(nèi)蛋白質(zhì)的含量，還可以有效增加可溶性糖的積累量．其中以100μmol/L SNP處理最為適宜，白菜幼苗的蛋白質(zhì)含量增加了4.22%，可溶性糖的含量增加了24%；以200μmol/L SNP處理時，可溶性糖的含量增加了2.9%，而蛋白質(zhì)的含量幾乎沒有發(fā)生變化；經(jīng)300μmol/L、400μmol/L、500μmol/L SNP處理時，可溶性糖含量逐漸減少，而白菜植株蛋白質(zhì)的含量跟對照組相比沒有明顯的變化．

表3 不同濃度一氧化氮對白菜幼苗可溶性糖和蛋白質(zhì)含量的影響

2.4 不同濃度一氧化氮供體SNP處理對白菜幼苗花芽分化的影響

由于高濃度SNP抑制白菜植株生長，處理后植株難以生長到抽苔開花階段．因此，與開花相關的指標分化率、抽苔和開花期的測定，采用四個較低濃度（50μmol/L、100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L）SNP 來處理．由花芽分化觀察的結果可知：在進行的4個SNP處理濃度中，100μmol/L SNP處理后的白菜花芽分化率最高，為32.75%，其次是150μmol/L處理的花芽分化率為23.33%，200μmol/L處理的花芽分化率為15.56%，50μmol/LSNP處理后的花芽分化率為17.52%．自然狀態(tài)下對照組的白菜花芽分化率為12.64%．因此我們認為經(jīng)4個SNP濃度處理后，對白菜花芽的發(fā)育起到了不同程度的促進作用，其中以100μmol/L的SNP處理對白菜花芽發(fā)育的促進效果最為顯著（圖1）．

圖1 不同濃度一氧化氮供體SNP對白菜花芽分化的影響

2.5 不同濃度一氧化氮供體SNP處理對白菜抽苔和初始花所需天數(shù)的影響

由圖2中數(shù)據(jù)可知，經(jīng)過100 μmol/L SNP處理的白菜植株，其抽苔和初始花所需要的時間最短；經(jīng)過50 μmol/L和150 μmol/L SNP處理后，白菜植株抽苔和初始花所需時間也出現(xiàn)不同程度的縮短，但100 μmol/L SNP處理后，抽苔和初始花時長變化最為顯著．

圖2 不同濃度一氧化氮供體SNP對白菜幼苗抽苔所需天數(shù)和初始花所需天數(shù)的影響

3 討論

近年來研究發(fā)現(xiàn)，作為氣體信號分子的NO在調(diào)節(jié)植物生長和發(fā)育的過程中不僅參與植物生長發(fā)育［16］，而且在植物體對各種脅迫反應的信息傳遞過程中有著不可忽略的作用［17～18］．一氧化氮對促進大多數(shù)植株種子的萌發(fā)、根的生長、葉片的生長、幼苗的生長等都有著重要的意義．用0.1mmol/L硝普鈉浸種能顯著提高超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）的活性，降低由NaCl處理引起的小麥氧化損傷［19］．

有花植物在生長發(fā)育的過程中一個非常重要的階段是花芽的分化階段，而且這個過程很容易受到植物體內(nèi)外各種環(huán)境因子的影響．通對試驗數(shù)據(jù)研究，經(jīng)外源一氧化氮供體SNP的處理可以起到促進白菜生長的作用，表現(xiàn)在植株株高、莖粗、葉片數(shù)都有不同程度的增加．不同濃度的一氧化氮供體SNP在0～200μmol/L范圍內(nèi)，白菜幼苗的株高、莖粗、葉片數(shù)會隨著一氧化氮濃度的增加而增長，在濃度為100μmol/L時達到最大值，在300μmol/L時開始出現(xiàn)抑制的現(xiàn)象．除此之外，用適宜的一氧化氮對白菜幼苗進行處理，引起植株體內(nèi)可溶性糖類的積累，而蛋白質(zhì)含量也有所增多，但差異不顯著．通過對白菜抽苔和初始花的所需天數(shù)的觀察，適當濃度的一氧化氮處理可以縮短白菜抽苔期和初始花的天數(shù)，從而促進白菜花芽的發(fā)育．但是濃度過低會造成促進作用的不明顯，相反如果濃度過高會抑制白菜花芽的發(fā)育．因此以100μmol/L的一氧化氮處理效果最為明顯．