蔡丹平，龍鼎新

(南華大學(xué) 船山學(xué)院， 湖南 衡陽 421001)

microRNAs(MiRNAs)是一類長(zhǎng)約18-25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，與mRNA轉(zhuǎn)錄本的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合，可以對(duì)靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控[1]。它們對(duì)各種重要的生物學(xué)過程具有調(diào)控作用，如細(xì)胞發(fā)育、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化及細(xì)胞凋亡等有關(guān)[2]，因此準(zhǔn)確預(yù)測(cè)miRNA的靶基因并對(duì)其靶基因進(jìn)行系統(tǒng)的生物學(xué)分析是研究其作用機(jī)制的重要環(huán)節(jié)。本研究前期為了探討miRNAs在三鄰甲苯基磷酸酯(Tri-o-cresyl phosphate，TOCP)誘發(fā)神經(jīng)細(xì)胞自噬中的作用機(jī)制，以人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞SK-N-SH細(xì)胞為體外細(xì)胞自噬模型，應(yīng)用miRNA基因芯片、RT-PCR等實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)了自噬相關(guān)miRNA表達(dá)情況。綜合芯片和熒光實(shí)時(shí)定量PCR的結(jié)果，篩選出了miR-210-5p顯著性差異表達(dá)的自噬基因。

Hsa-miR-210-5p屬于miR-210基因家族，定位于人11號(hào)染色體568 150-568 171。研究表明低氧誘導(dǎo)的miR-210參與細(xì)胞循環(huán)、細(xì)胞分化、DNA修復(fù)、細(xì)胞凋亡、膜轉(zhuǎn)運(yùn)、氧化應(yīng)激/糖酵解等調(diào)控信號(hào)通路，可作為非小細(xì)胞癌、乳腺癌、胰腺癌、肺細(xì)胞癌、食管鱗狀細(xì)胞癌等癌癥的診斷參考指標(biāo)和預(yù)后指標(biāo)[3]，其過表達(dá)與晝夜節(jié)律過程、神經(jīng)元發(fā)育、GTP酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和光感受相關(guān)的途徑有關(guān)[4]，但目前國(guó)內(nèi)外對(duì)miR-210-5p的報(bào)道較少。本研究運(yùn)用生物信息學(xué)分析，預(yù)測(cè)hsa-miR-210-5p的靶基因，繪制韋恩圖得靶基因集合，并對(duì)其靶基因集合進(jìn)行蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)分析、GO(Gene Ontology)分析和KEGG Pathway(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析預(yù)測(cè)結(jié)果中的靶基因集合作用機(jī)制，并注釋其靶基因的生物學(xué)功能，為展開miR-210-5p的靶基因鑒定及生物學(xué)功能研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 miR-210-5p序列的保守性分析

使用miRbase[5](http://www.mirbase.org/)、RNAcentral(https://rnacentral.org/)數(shù)據(jù)庫在線查找各物種已知成熟miR-210-5p堿基序列，對(duì)比分析miR-210-5p序列在各物種間的保守性。

1.2 miR-210-5p靶基因的預(yù)測(cè)

利用miRDB[5](www.mirdb.org/)，TargetSc-an[5](http://www.targetscan.org/)和DIANA TO-OLS[5](http://diana.imis.athena-innovation.gr/) 3個(gè)在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-210-5p的靶基因，用在線軟件Veney 2.1.0 (http//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/Venny/index.html)畫韋恩圖，得到3個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果的交集，該交集為靶基因集合，以降低假陽性率。

1.3 預(yù)測(cè)靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用

將該靶基因集合使用String 11.0(Search Tool for the retrieval of interacting genes)在線數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)分析，繪制互作網(wǎng)絡(luò)鄰接編碼蛋白數(shù)目柱狀圖，再利用Cytoscape_v3.6.1繪制靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間相互作用(protein-protein interaction, PPI)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 miR-210-5p靶基因的GO分析

使用DAVID(https: //david. ncifcrf. gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)到的miR-210-5p靶基因集合進(jìn)行GO功能注釋，以人的所有基因?yàn)楸尘盎?，顯著性閾值取P< 0.05，獲得相對(duì)hsa-miR-210-5p具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的GO分析。GO分析由細(xì)胞組分(Cellular component)、分子功能(Molecular function)、生物調(diào)節(jié)(Biological process)3個(gè)部分組成。用R軟件繪制miR-210-5p靶基因交集的GO功能注釋圖。

1.5 miR-210-5p靶基因的KEGG Pathway分析

使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)到的miR-210-5p靶基因集合進(jìn)行KEGG Pathway富集分析，以人的所有基因?yàn)楸尘盎?，顯著性閾值取P< 0.05，獲得相對(duì)于hsa-miR-210-5p具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因集合信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。用R軟件繪制miR-210-5p靶基因交集的KEGG Pathway富集通路圖。

2 結(jié)果分析

2.1 miR-210-5p參與的疾病

miR-210-5p在骨質(zhì)疏松[6]、骨關(guān)節(jié)炎[7]、自閉癥障礙[8]，心血管疾病[9]中起上調(diào)作用(見表1)。

表1 miR-210-5p調(diào)控靶基因參與人類的部分疾病Table 1 miR-210-5p target genes involved in parts of human diseases

*注：該靶基因是小鼠模型試驗(yàn)獲得，尚無人類試驗(yàn)驗(yàn)證。

Note:The target genes was were obtained by mouse model test and have not been verified by human test.

2.2 各物種成熟miR-210-5p序列的保守性分析

使用RNAcentral和miRBase數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對(duì)比分析，可知其基因序列號(hào)為MIMAT002475，定位于11號(hào)染色體568 150-568 171。對(duì)獼猴(mml)、小鼠(mmu)、褐家鼠(rno)等8個(gè)物種對(duì)比分析，可知hsa-miR-210-5p的成熟堿基序列“agccccugcccaccgcacacug”在各物種間高度保守(見表2)。

表2 各物種miR-210-5p的成熟堿基序列Table 2 Mature base sequences of miR-210-5p of various species

2.3 預(yù)測(cè)靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用使用數(shù)據(jù)庫miRDB，TargetScan和DIANA TOOLS預(yù)測(cè)miR-210-5p的靶基因，預(yù)測(cè)的個(gè)數(shù)分別為401、4 048和87，然后用在線軟件Veney 2.1.0可得三個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)靶基因的交集23個(gè)，占各預(yù)測(cè)軟件預(yù)測(cè)靶基因總和的0.6%(見圖1)。

圖1 miR-210-5p的預(yù)測(cè)靶基因個(gè)數(shù)Fig.1 Prediction of the number of target genes for miR-210-5p

2.4 預(yù)測(cè)靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用

將三個(gè)數(shù)據(jù)庫得到的靶基因集合使用String 11.0數(shù)據(jù)庫分析，繪制出互作網(wǎng)絡(luò)鄰接編碼蛋白數(shù)目柱狀圖(見圖2)。結(jié)果顯示，靶基因CDK8、MED18、MED13、MED12、CCNC、MED14、MED23、CDK19、MED1、MED15和MED13L的編碼蛋白質(zhì)所占比重較大。運(yùn)用Cytoscape_ v 3.6.1軟件，繪制出PPI網(wǎng)絡(luò)圖(見圖3)。結(jié)果表明，miR-210-5p的靶基因集合編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用關(guān)系較復(fù)雜，有10個(gè)編碼蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系較穩(wěn)定。

2.5 miR-210-5p靶基因的GO功能注釋

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)到的miR-210-5p靶基因集合進(jìn)行GO功能注釋，以人的所有基因?yàn)楸尘盎?P< 0.05)，可得其主要富集的細(xì)胞組分是細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞漿和突觸前活動(dòng)區(qū)；分子功能是參與鳥苷酸合成；參與突觸小泡胞吐的調(diào)控、鳥苷酸蛋白介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、鈣離子調(diào)節(jié)的神經(jīng)遞質(zhì)胞吐和膜電位調(diào)節(jié)等生物學(xué)過程(見表3)，用R軟件繪制miR-210-5p靶基因交集的GO功能注釋圖(見圖4)。

圖2 互作網(wǎng)絡(luò)鄰接編碼蛋白數(shù)目柱狀圖Fig.2 Adjacency coding protein number histogram of interaction networks

圖3 miR-210-5p預(yù)測(cè)靶基因集合所編碼蛋白質(zhì)之間的相互作用Fig.3 Protein-protein interaction network of the target genes of miR-210-5p

表3 miR-210-5p靶基因交集的GO功能注釋
Table 3 GO functional annotation for intersection of miR-210-5p target genes

GO IDTermP-valueNumberGenesCellular ComponentGO:0005737cytoplasm0.02812UDT16, RAB3B, PLA2G4F, OSBP, DCAF7, ARHGAP35, STK35, POU2F2, MFAP3L, SRF, BICD2, AKT3GO:0048786presynaptic active zone0.0342RIMS4, RIMS3Molecular FunctionGO:0005525GTP binding0.0104NUDT16, RASL11B,AB3B, ARHGAP35Biological ProcessGO:2000300regulation of synaptic vesicle exocytosis0.0122RIMS4, RIMS3GO:0007264small GTPase mediated signal transduction0.0343RASL11B, RAB3B, ARHGAP35GO:0048791Calciumion regulated exocytosisof neurotransmitter0.0452RIMS4, RIMS3GO:0042391regulation of membrane potential0.0862RIMS4, RIMS3

圖4 miR-210-5p靶基因交集GO功能注釋Fig.4 GO functional annotation for intersection of miR-210-5p target gene

2.6 miR-210-5p靶基因的KEGG Pathway分析

使用DAVID數(shù)據(jù)庫對(duì)預(yù)測(cè)到的miR-210-5p靶基因集合進(jìn)行KEGG Pathway分析，以人的所有基因?yàn)楸尘盎?P< 0.05)，可得miR-210-5p的靶基因集合參與血小板活化、MAPK信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、癌癥通路、甲狀腺激素信號(hào)通路等(見表4)，用R軟件繪制miR-210-5p靶基因交集的KEGG pathway通路圖(見圖5)。

表4 miR-210-5p靶基因交集的KEGG Pathway分析Table 4 KEGG pathway analysis for intersection of miR-210-5p target genes

圖5 miR-210-5p靶基因交集的KEGG Pathway分析Fig.5 KEGG pathway analysis for intersection of miR-210-5p target genes

3 討 論

miR-210在腫瘤、心血管系統(tǒng)，神經(jīng)系統(tǒng)疾病中起發(fā)揮重要作用。miR-210能上調(diào)Kaposi肉瘤相關(guān)的皰疹病毒和感染[11]、慢性鼻-鼻竇炎鼻息肉患者黏膜黏蛋白0型聚糖生物合成途徑[12]、人骨肉瘤[13]，小鼠感覺軸突再生[14]和脊髓再生[15]，可通過在動(dòng)脈粥樣硬化的情況下直接靶向PDK1誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有下調(diào)作用[16]，能抑制滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲，是先兆子癇的血清生物標(biāo)志物[17]。hsa-miR-210-5p屬于miR-210基因家族，miRNA-210-5p在神經(jīng)功能調(diào)節(jié)中報(bào)道較少。

考慮到靶基因預(yù)測(cè)過程中miRNA與靶基因結(jié)合位點(diǎn)的序列匹配、mRNA與miRNA雙鏈特異結(jié)合的熱穩(wěn)定性及序列的保守性等因素,采用miRDB、TargetScan，DIANA TOOLS三個(gè)數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-210-5p靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，得到了可信度較高的靶基因集合，進(jìn)行編碼蛋白質(zhì)互作分析，GO分析和KEGG pathway分析。研究發(fā)現(xiàn)miR-210-5p能促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化[6]、成骨細(xì)胞胞外體的表達(dá)[7]、調(diào)節(jié)鈣通道[8]、促進(jìn)細(xì)胞缺氧凋亡[9]、能結(jié)合位點(diǎn)突變，降低熒光酶活性[10]、參與細(xì)胞的免疫反應(yīng)[18]、阻斷胚狀體細(xì)胞擴(kuò)增[19]、對(duì)孕婦發(fā)生先兆子癇[20]、腎細(xì)胞癌[21]，在副溶血性孤菌感染的文昌魚的免疫反應(yīng)中起著重要調(diào)節(jié)作用[22]。提示miR-210-5p可能調(diào)控癌癥的發(fā)生與轉(zhuǎn)歸、鈣離子信號(hào)通路、血小板活化，免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)等生物學(xué)過程。miR-210-5p靶向TNS1和STC1調(diào)節(jié)缺氧時(shí)心肌細(xì)胞發(fā)生的變化，進(jìn)而調(diào)控心血管疾病[9]。在TargetScan Human 7.2可查到基因TNS1與miR-210-5p種子區(qū)域的配對(duì)類型為7mer-m8、7mer-A1和8mer，基因STC1與miR-210-5p種子區(qū)域的配對(duì)類型為7mer-m8，并且它們與miR-210-5p非種子區(qū)域3'端存在不同長(zhǎng)度的互補(bǔ)位型(見表5)。miR-210-5p種子區(qū)域與TNS1 和STC1基因的3’UTR完全匹配可以增強(qiáng)miR-210-5p對(duì)TNS1和STC1基因的沉默效果，故可用miR-210-5p與TNS1和STC1基因的高特異性來研究miR-210-5p對(duì)TNS1和STC1基因富集的疾病通路如心血管疾病的治療是具有發(fā)展意義的。

表5TNS1 和STC1基因3'UTR結(jié)合miR-210-5p的位點(diǎn)
Table 5 3’UTR sequences ofTNS1 andSTC1 targeted by miR-210-5p

4 結(jié) 論

選用三種數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)miR-210-5p靶基因，取其交集分析，不能避免預(yù)測(cè)結(jié)果的假陽性，需通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該靶基因集合里23個(gè)靶基因?yàn)閙iR-210-5p的靶基因，進(jìn)一步探討目標(biāo)靶基因3’UTR結(jié)合miR-210-5p的位點(diǎn)及其具體分子機(jī)制來降低假陽性率。運(yùn)用生物信息學(xué)分析方法，較全面的分析了hsa-miR-210-5p所參與的生物學(xué)過程，為后續(xù)研究提供了方向。