李小康，魚 濤，李 紅，杜明明，屈撐囤，2

（1.西安石油大學(xué)陜西省油氣田環(huán)境污染控制技術(shù)與儲層保護(hù)重點實驗室，陜西西安 710065；2.石油石化污染物控制與處理國家重點實驗室，北京 102206）

0 前言

石油烴化合物作為不同行業(yè)的主要能源和材料，由于用途較廣、使用量大，導(dǎo)致石油類物質(zhì)每年大量流入土壤和水體中，對生態(tài)環(huán)境產(chǎn)生負(fù)面影響［1-2］。石油物質(zhì)引起污染的途徑很多，主要包括石油大規(guī)模生產(chǎn)、運輸、煉制、航運活動、意外溢油等［3］。若不及時治理，這些污染會不斷向周圍環(huán)境擴(kuò)散，并在新的環(huán)境中積累而達(dá)到較高的污染水平，給環(huán)境中的生命構(gòu)成直接或間接的健康危害［4-5］。石油污染物被列為污染廣泛的有毒化合物［6］。近年來，對石油污染物的控制已成為環(huán)境保護(hù)的重要問題［7］。因此，以環(huán)保和健康為宗旨清潔這些石油污染是非常必要的，廣大學(xué)者已研究并總結(jié)出一系列治理污染的技術(shù)［8］。相比于物理和化學(xué)的修復(fù)方法，生物處理是一種費用低、操作簡單、環(huán)境友好的處理方法［9-10］，不會對環(huán)境產(chǎn)生有害影響。但由于微生物修復(fù)的效率普遍較低，嚴(yán)重阻礙了微生物修復(fù)技術(shù)的實際應(yīng)用，同時，降解石油污染的過程復(fù)雜多樣，不同菌株對原油的降解效果也各有差異，不同的環(huán)境條件和菌株間的相互作用也會影響原油的降解效果［11-12］。本文主要針對陜西定邊油田附近石油污染土壤的修復(fù)構(gòu)建高效的混合菌群，分析了它們的降解能力和降解過程中菌劑的組合配比，找尋提高它們降解能力的方法，為后續(xù)工程實踐提供理論基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

含菌土壤：挖掘陜西定邊與靖邊油田附近的原油污染土壤表層10數(shù)20 cm的土壤，經(jīng)自然風(fēng)干，破碎研磨、混勻、過0.85 mm 篩后密封，用于降解菌的分離與富集。

營養(yǎng)原油培養(yǎng)基：將4.8 g K2HPO4·3H2O、1 g（NH4）2SO4、1.5 g KH2PO4、0.2 g MgSO4·7H2O，0.5 g Na3C6H5O7·2H2O、0.1 g酵母粉和0.002 g CaCl2·2H2O 逐一加入超純水中進(jìn)行溶解，定容到1000 mL，用2 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調(diào)節(jié)pH 為7.0數(shù)7.2，制成營養(yǎng)培養(yǎng)基。取營養(yǎng)培養(yǎng)基100 mL，定量加入0.2 g原油（含飽和烴81.58%、芳香烴7.86%、膠質(zhì)7.26%、瀝青質(zhì)1.06%，回收率97.76%），將培養(yǎng)基置于121℃下高壓滅菌25 min。

LB 培養(yǎng)基：將10 g 蛋白胨、10 g NaCl 和5 g 酵母浸粉加入1000 mL的超純水中進(jìn)行溶解，制備LB培養(yǎng)基。

DNP-9272A型恒溫培養(yǎng)箱，常州恒隆儀器有限公司；LDZX-30KBS 型立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；OIL-460型紅外分光測油儀，北京華夏科創(chuàng)儀器技術(shù)有限公司；JYW-200A 型表面張力測定儀，承德金和儀器制造有限公司；SPX-150 GH型隔水培養(yǎng)箱，北京科偉永興儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 石油降解菌株的篩選與分離

將2.0 g預(yù)處理后的含菌土樣加入100 mL的含2 g/L 原油的營養(yǎng)原油培養(yǎng)基中，在150 r/min、30℃的恒溫震蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移到另一個新鮮營養(yǎng)原油培養(yǎng)基中振蕩富集培養(yǎng)7 d，重復(fù)4次。使用稀釋涂布平板法培養(yǎng)單個菌落，培養(yǎng)2數(shù)4 d 左右，挑取菌落特征明顯的單一菌落進(jìn)行編號保存。

1.2.2 生理生化特性鑒定及分子生物學(xué)鑒定

根據(jù)文獻(xiàn)［13-14］提供的方法對已保存菌株進(jìn)行生理生化和形貌的分析鑒定。對純化的細(xì)菌進(jìn)行16S rDNA 的聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增，建立和表征不同種屬的細(xì)菌種類。利用通用引物為模板對菌株 進(jìn)行16S rRNA 基因的擴(kuò)增，通用引物為［15］：27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'；1492 R：5'-TACCTTGTTACGACTT-3'。

具體反應(yīng)體系為：Template（基因組DNA 20數(shù)50 ng/μL）0.5 μL，10×Buffer（with Mg2+）2.5 μL，dNTP（各2.5 mM）1 μL，酶0.2 μL，F(xiàn)（10 uM）0.5 μL，R（10 uM）0.5 μL，加雙蒸H2O 至25 μL，總反應(yīng)體系共30.2 uL。PCR 擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94℃4 min；30 cycle 94℃45 sec，55℃45 sec，72℃1 min；72℃延伸10 min。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序并在NCBI進(jìn)行比對分析，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌株的生長特性分析

向12 支試管中分別加入5 mL 的LB 液體培養(yǎng)基，在121℃下滅菌30 min，使用接種環(huán)接種篩選的石油降解菌（600 nm波長處的吸光度值OD600=0.5），并標(biāo)注編號，放入恒溫振蕩培養(yǎng)箱在35℃、180 r/min條件下培養(yǎng)，每6 h取樣1次，使用可見分光光度法測定吸光度值，并求出OD600值［16］。使用原油培養(yǎng)基探究菌株以石油為碳源情況下的生長狀況，由于培養(yǎng)基中原油在6 h 左右會被細(xì)菌乳化，故不能采用分光光度法測量細(xì)菌的OD600值，選用平板涂布法［17］測定不同時間下的菌數(shù)。

1.2.4 原油降解率的測定

在100 mL 的原油培養(yǎng)基中加入0.2 g 原油，滅菌后繼續(xù)加入3%接種量的純化菌液（OD600=0.6），并設(shè)置2個平行樣和空白對照，在37℃、180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)7 d 后，使用四氯化碳萃取剩余的原油，使用紅外測油儀測定剩余的總石油烴的量。利用所測數(shù)據(jù)按照式（1）計算原油降解率：

其中，ν—原油降解率；c1—無菌對照樣品中原油的總烴類含量，mg/L；c2—接菌樣品中原油的總烴類含量，mg/L。

1.2.5 單菌降解殘余烴類組成分析

用CH2Cl2萃取細(xì)菌降解7 d 后的原油培養(yǎng)基，使用無水Na2SO4除去萃取液中殘余水分后進(jìn)行GC-MS分析。GC-MS分析條件：色譜柱為DB-5MS毛細(xì)管柱30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為高純度He氣，流速1 mL/min；在80℃下保持5 min，然后以6℃/min升溫速率升至180℃，保持2 min，再以10℃/min 的升溫速率升至300℃，保持10 min；分流比為10∶1。

1.2.6 復(fù)配菌株對原油降解效果分析

如表1所示，采用A-3、D-5、C-2這3株原油降解菌株進(jìn)行正交試驗，培養(yǎng)基中原油濃度為2 g/L，在溫度35℃、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min 下降解反應(yīng)7 d。通過正交試驗和SPSS 主體間效應(yīng)分析，探究復(fù)合菌加量對原油降解率的影響，找到最佳復(fù)配比例。

表1 正交實驗因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 菌株的分離與鑒定

菌株經(jīng)過多次的轉(zhuǎn)接、篩選、純化后，分離出5株對原油降解作用明顯且活性較高的石油降解菌D-5、C-2、A-3、D-3、D-1，其生理生化特性如表2 所示。使用MEGA7 軟件對A-3、D-5、C-2 的基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果如圖1所示。

2.2 菌株的生長狀況

分離的不動桿菌D-5、無色桿菌C-2、銅綠假單胞菌A-3、黏質(zhì)沙雷氏菌屬D-3、纖維單胞菌D-1 在LB培養(yǎng)基的生長曲線如圖2所示。分離的5種菌株生長狀況各有差異，其中A-3、C-2的生長狀況最好，對數(shù)期菌株增長較快，A-3、C-2和D-5分別在25、30和30 h 左右達(dá)到穩(wěn)定期。A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的混合菌群E 在LB 培養(yǎng)基的生長曲線也見圖2?；旌暇鶨呈現(xiàn)S型增長趨勢，細(xì)菌生長量也達(dá)到較高水平，在LB 培養(yǎng)基中45 h 時OD600值達(dá)到1.94，在原油培養(yǎng)基中菌數(shù)達(dá)到4.3×1015個/mL。Cornforth D M等［18］研究表明，當(dāng)混合菌生長曲線為S 型增長時，菌株之間將不存在拮抗作用。因此可以將A-3、C-2、D-5這3株細(xì)菌作為混合菌降解石油污染物。D-3、D-1 的生長量較低，這可能是由于培養(yǎng)基本身不適合該細(xì)菌的生長繁殖。張東升等［19］研究認(rèn)為，細(xì)菌在不同培養(yǎng)基中的適應(yīng)能力和生長狀況各有不同，有些培養(yǎng)基還會抑制微生物自身生長代謝，降低微生物活性。分離的D-5、C-2、A-3、D-3、D-1 等5 種菌株和A-3、C-2、D-5 以1∶1∶1 的投加量混合的菌混合菌群E在原油培養(yǎng)基中的生長曲線如圖3所示。混合菌群E在培養(yǎng)基中依然表現(xiàn)出較高的細(xì)菌生長量，D-5、A-3 也呈現(xiàn)較好增長的趨勢，C-2 相比于D-3、A-1 生長趨勢也較好。綜合可得，A-3、C-2、D-5 這3 株細(xì)菌無論是在獨立條件還是混合條件下，在原油中均表現(xiàn)出很高的生物活性，可以用作治理石油污染的修復(fù)菌劑。

表2 分離菌株形態(tài)與生理生化鑒定

圖1 菌株16S rDNA基因序列發(fā)育樹

圖2 菌株在LB培養(yǎng)基中的生長曲線

圖3 菌株在原油培養(yǎng)基中的生長曲線

2.3 細(xì)菌對原油的降解效果

細(xì)菌D-5、C-2、A-3、D-1和混合菌群E對原油的降解率如圖4所示。由圖4可見，D-5和A-3對原油的降解效率均達(dá)到60%以上，C-2 對原油的降解率也達(dá)到39.36%。D-3由于降解過程中會將水中分散的原油聚集成為不溶于水和有機(jī)溶劑的團(tuán)狀物質(zhì)，無法使用紅外測油儀測定降解率，夾出水中團(tuán)塊物質(zhì)后水中含油量幾乎為0。分析可能是細(xì)菌自身分泌的一些胞外物質(zhì)對原油產(chǎn)生了聚集包覆作用［20］?；旌暇篍 對石油的降解率最高，可能是微生物之間的協(xié)同作用改善了原油的疏水性和乳化性，增強(qiáng)了微生物對原油的利用效率［21］，具體情況有待進(jìn)一步研究。結(jié)合圖3 可知，混合菌在相同培養(yǎng)環(huán)境下的生長量比其它菌株的略高，也反映出微生物對石油的利用率增強(qiáng)。

圖4 各菌株7 d后對原油的降解率

2.4 殘烴的GC-MS分析

單菌（OD600=0.6）和混合菌E 在2 g/L 石油含量的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中反應(yīng)7 d 后，萃取剩余油相進(jìn)行GC-MS 分析，結(jié)果如圖5 所示。由圖5 可知，A-3、D-5 和混合菌E 可以高效地降解原油組分中的C16、C17、C18、C19、C21、C44等烴類，且都表現(xiàn)出較強(qiáng)的石油降解能力；而D-1、C-2降解石油組分的能力相對較低。

2.5 菌株的乳化能力和表面活性劑對菌株降解能力的影響

篩選產(chǎn)表面活性劑菌株的方法較多，不同菌株分泌的表面活性劑種類不同，單一方法不能準(zhǔn)確測定菌株分泌表面活性劑的能力［22-23］。表3 為血平板乳化實驗和菌株降解后培養(yǎng)液表面張力的測定結(jié)果。將5種菌株接種到血平板上，在20℃下經(jīng)過2 d的恒溫培養(yǎng)，只有A-3、D-5 生成了大小不同的透明乳化圈，且發(fā)酵液的表面張力的差異不大?？赡苁怯捎谘桨迮囵B(yǎng)基不能很好地促進(jìn)菌株生成表面活性劑。其他3 種菌株均未產(chǎn)生透明的乳化圈，發(fā)酵液表面張力基本接近空白培養(yǎng)基的表面張力，因此菌株對培養(yǎng)基中原油的降解率低［24］。

圖5 各菌株降解原油后剩余組分的GC-MS分析

向培養(yǎng)基中加入4 mL的質(zhì)量濃度為10 g/L的表面活性劑Tween 80，降解反應(yīng)7 d后單菌對原油的降解率如表4所示。結(jié)果表明，向培養(yǎng)基中加入表面活性劑Tween 80后，5株細(xì)菌對原油的降解率均有所提高，其中C-2對原油的降解率提升最高，達(dá)到70.84%。

表3 各菌株分泌表面活性劑的能力

表4 各菌株在有Tween80的情況下對原油的降解率

2.6 高效降解菌群的復(fù)配

不同菌株降解原油中各組分物質(zhì)的效率和方式存在差異，菌株之間也會相互影響，當(dāng)菌株之間相容性較高或存在協(xié)同關(guān)系時，混合菌群能發(fā)揮最大的降解作用。研究表明，混合菌株投加比例合適時，會進(jìn)一步提高細(xì)菌的降解效率［25-26］。D-5、C-2和A-3按不同比例混合的混合菌對原油的降解率見表5，SPSS主體間效應(yīng)的檢驗結(jié)果分析見表6。由表5可知，混合菌群在D-5、C-2 和A-3 之間的最佳接種比例5∶1∶5時對石油的降解效果最好。結(jié)合表6主體間效應(yīng)檢驗結(jié)果的Sig 值（0.05＜D-5＜A-3＜C-2，即0.05＜0.129＜0.354＜0.502）來看，3株菌對原油降解率均不產(chǎn)生顯著性影響，但混合菌群能有效地降解原油，說明各菌群對石油的降解均起到一定作用，其中D-5 對石油污染物的降解效果影響最大，其次是A-3、C-2。通過實驗發(fā)現(xiàn)，在最佳條件（溫度35℃、pH 7.5、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、菌液加量6 mL）下，最佳接種比例的混合菌群在原油培養(yǎng)基中對原油的降解率達(dá)到74.18%。

表5 菌株復(fù)配正交試驗與極差分析

表6 SPSS主體間效應(yīng)的檢驗結(jié)果分析

2.7 Tween80加量對菌株降解能力的影響

通過以上探究發(fā)現(xiàn)，加入Tween80 可以明顯提升菌株對原油降解能力。表面活性劑對原油有較強(qiáng)的乳化作用，適量加入會提高微生物自身的活性，增強(qiáng)對原油的降解，但加入過量的表面活性劑會對微生物產(chǎn)生毒害作用［27］。研究表明［28-29］，投加的表面活性劑未達(dá)到臨界膠束濃度cmc 前，疏水性有機(jī)化合物的溶解性不能得到顯著提升。通過“拉環(huán)法”測定了加有不同量的Tween80 原油培養(yǎng)基的表面張力，結(jié)果見圖6。經(jīng)測Tween80 在原油培養(yǎng)基中的cmc值為30 mg/L，此時培養(yǎng)基的表面張力趨于穩(wěn)定。為了進(jìn)一步提高復(fù)配菌株對原油的降解效率，考察了不同Tween 80加量下復(fù)配菌株對原油的降解速率，結(jié)果見圖7。當(dāng)培養(yǎng)基中Tween 80 加量為30 mg/L（1 cmc）時，降解7 d后混合菌群對原油的降解效果低于未添加Tween 80的，當(dāng)Tween 80加量為150 mg/L（5 cmc）時，降解7 d 后混合菌群對原油的降解效果高于未添加Tween 80的，降解率達(dá)到了87.12%，能很好地應(yīng)用于石油污染的修復(fù)。

圖6 Tween80在培養(yǎng)基中的cmc值測定

圖7 Tween80加量對菌群降解效果影響

3 結(jié)論

從陜北定邊、靖邊油田原油污染土壤中篩選的原油降解菌中不動桿菌D-5、無色桿菌C-2、銅綠假單胞菌A-3對原油的降解率分別為61.46%、39.36%和62.42%，其中，D-5、A-3 可降解原油中大分子烴類，降解作用明顯，C-2 的生物活性高，與菌株A-3、D-5 有較好的相容性，在表面活性劑作用下降解效果顯著。將這3 種菌株進(jìn)行復(fù)配，復(fù)配后的混合菌在LB 培養(yǎng)基中45 h 時OD600值達(dá)到1.94，在原油培養(yǎng)基中菌數(shù)達(dá)到4.3×1015個/mL，比單菌數(shù)量有所提升。在溫度為35℃、pH 為7.5、搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min、復(fù)配菌劑加量比D-5∶C-2∶A-3 為5∶1∶5、加量為6%、表面活性劑Tween80 濃度為150 mg/L 時，混合菌的降解效果可達(dá)到87.12%，能很好地應(yīng)用于石油污染的修復(fù)。