周雪清，劉倩倩，張 杰，劉文慧，楊姝婭，駱耐香③

(1.桂林醫(yī)學院免疫學教研室，廣西 桂林 541004；2.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院檢驗科，四川 南充 637000；3.桂林醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院檢驗科，廣西 桂林 541199)

流行病學研究表明，乳腺癌已成為威脅全球女性健康和生命主要的因素之一[1]，而肥胖與乳腺癌的患病風險和其臨床行為密切相關[2]。瘦素(leptin)是由脂肪組織分泌的與肥胖有關的重要激素，能夠與瘦素受體結(jié)合后通過調(diào)節(jié)飲食攝入和能量代謝參與體內(nèi)內(nèi)環(huán)境平衡的維持[3]，同時它還參與了機體卵巢癌、胃腸道腫瘤等多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[4]。膜型基質(zhì)金屬蛋白酶(membrane-type matrix metalloproteinase-1，MT1-MMP)即MMP14屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，它直接或間接降解細胞外基質(zhì)中的多種成分，與腫瘤的侵襲與遷移密切相關[5]。已知瘦素與MMP14均可促進乳腺癌的發(fā)生與發(fā)展[2-5]，而兩者之間在乳腺癌是否有關聯(lián)目前尚無相關的研究報道。因此，本課題組以乳腺癌細胞系為研究對象，探討瘦素是否可以通過影響MMP14的表達促進乳腺癌發(fā)生和發(fā)展，為開發(fā)一種乳腺癌新型治療靶點提供思路。

1 材料與方法

1.1 細胞株與主要試劑

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231購自中國科學院上海細胞庫。人重組瘦素購自美國 Peprotech公司，RPMI1640培養(yǎng)基及胰蛋白酶由美國Gibco公司提供，胎牛血清由美國Gemini公司提供，兔抗人MMP14抗體由Abcam公司提供，鼠抗人β-actin抗體及相關二抗由北京中山金橋生物有限公司提供，MTT試劑盒由北京索萊寶科技有限公司提供，ERK1/2、JNK、P38的信號通路抑制劑FR180204、SP600125、SB203580均由上海藍木化工有限公司提供。

1.2 細胞培養(yǎng)

人乳腺癌細胞株MDA-MB-231用含有10% 胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基于37 ℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中溫育。

1.3 western blot法檢測細胞MMP14的蛋白表達水平

將處于對數(shù)生長期乳腺癌細胞接種于6孔板中，分對照組(不加瘦素)、不同濃度瘦素組(25，50，100，200，400 ng/ml)及瘦素+不同信號通路抑制劑組，作用24 h后提取各組細胞總蛋白，用western blot法檢測各組細胞MMP14的蛋白表達。實驗獨立重復3次。

1.4 MTT法檢測細胞增殖率

將處于對數(shù)生長期乳腺癌細胞經(jīng)胰酶消化，制成單細胞懸液后，接種于96 孔板中，分二甲基亞砜(DMSO)組(溶劑組)、瘦素+DMSO組(對照組)及瘦素+不同通路抑制劑組，檢測作用0，1，2，3，4 d的吸光度值。每組設6個復孔，計算平均值。實驗獨立重復3次。

1.5 劃痕實驗檢測細胞遷移能力

取對數(shù)生長期乳腺癌細胞接種于12孔板中，分DMSO組、瘦素+DMSO組及瘦素+不同通路抑制劑組。瘦素作用前，用200 μl移液器槍頭在12孔板內(nèi)垂直劃痕，PBS清洗2遍，然后換成含1%胎牛血清的培養(yǎng)基并做相應的組別處理。各組分別加入DMSO、瘦素+DMSO、瘦素+不同通路抑制劑(瘦素濃度100 ng/ml，各通路抑制劑濃度均為500 ng/ml)，在鏡下觀察，根據(jù)乳腺癌細胞的生長周期選擇每12 h為1個觀察時間點觀察細胞遷移變化并拍照直至劃痕完全愈合，計算平均劃痕愈合率。實驗獨立重復3次。

1.6 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 不同濃度瘦素處理后乳腺癌細胞MMP14的蛋白表達水平

western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，25，50 ng/ml瘦素組MMP14表達水平?jīng)]有差異， 100，200，400 ng/ml瘦素組MMP14表達水平明顯高于對照組(P<0.05或P<0.01)，且隨著瘦素濃度的增加而升高。詳見圖1。

圖1 不同濃度瘦素處理乳腺癌細胞24 h后MMP14的蛋白表達(*P<0.05，P<0.01，*P<0.001)

2.2 瘦素聯(lián)合DMSO及不同通路抑制劑處理后乳腺癌細胞MMP14的蛋白表達水平

western blot結(jié)果顯示，與DMSO組相比，瘦素+DMSO組MMP14蛋白表達明顯升高(P<0.001)。與瘦素+DMSO組相比，瘦素+JNK 通路抑制劑組MMP14的蛋白表達量明顯降低(P<0.001)，而瘦素+ERK組及瘦素+P38組MMP14蛋白的表達均明顯升高(P<0.01)。詳見圖2。

圖2 瘦素聯(lián)合DMSO及不同通路抑制劑處理乳腺癌細胞后MMP14的蛋白表達水平(P<0.01，*P<0.001)

2.3 瘦素聯(lián)合不同通路抑制劑處理后乳腺癌細胞增殖能力的變化

MTT結(jié)果顯示，隨著培養(yǎng)時間的延長，瘦素+DMSO組的乳腺癌細胞增殖率均高于DMSO組(P<0.05或P<0.01)。瘦素+不同通路抑制劑組的細胞增殖率在第1～2天與瘦素+DMSO組無明顯差異，在第3～4天則明顯低于瘦素+DMSO組(P<0.05或P<0.01)，在第3天瘦素聯(lián)合JNK通路抑制劑組的細胞增殖率降低最為顯著。詳見圖3。

圖3 瘦素聯(lián)合不同通路抑制劑作用后乳腺癌細胞增殖情況(*P<0.05，P<0.01，*P<0.001)

2.4 瘦素聯(lián)合不同通路抑制劑處理后乳腺癌細胞遷移能力的變化

劃痕實驗結(jié)果顯示，瘦素+DMSO組的乳腺癌細胞遷移率在各檢測時間點均明顯高于DMSO組(P<0.05)，瘦素+不同抑制劑組的細胞遷移率較瘦素+DMSO組均顯著降低(P<0.01)。詳見圖4。

圖4 瘦素聯(lián)合不同通路抑制劑作用后乳腺癌細胞遷移率(*P<0.05，P<0.01，*P<0.001)

3 討論

有研究表明，脂肪組織不僅在調(diào)節(jié)全身能量代謝中發(fā)揮重要作用，還能分泌包括瘦素和脂聯(lián)素等因子[6]。瘦素由位于7號染色體的OB基因編碼的蛋白質(zhì)多肽類激素，主要由體內(nèi)白色脂肪細胞合成分泌，包含167個氨基酸，分子量為16 KD[7]。瘦素通過與相應受體的結(jié)合，激活JAK-STAT通路以及絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、胰島素受體底物(IRS)、磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)、蛋白激酶C(PKC)和Rho家族GTPase等從而發(fā)揮作用[8-10]。體內(nèi)瘦素的含量肥胖型乳腺癌患者高于非肥胖者，這與乳腺癌高侵襲性及不良預后關系密切[2]。瘦素可通過影響包括上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)移、細胞與細胞外基質(zhì)(ECM)的黏附以及ECM組分的蛋白水解等促進腫瘤轉(zhuǎn)移[11-12]。瘦素還可通過富集調(diào)節(jié)性T細胞，分泌免疫抑制因子，使腫瘤逃脫宿主的免疫監(jiān)視，加速腫瘤的發(fā)生發(fā)展[13]?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMP)也在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中促進腫瘤的侵襲和遷移[5]。已發(fā)現(xiàn)人類存在6種不同的膜型MMP(MT-MMPs)，包括4種通過跨膜區(qū)域錨定在質(zhì)膜上的Ⅰ型MT-MMP，即MT1-MMP、MT2-MMP、MT3-MMP和MT5-MMP，以及兩種糖基磷脂酰肌醇錨定的MT4-MMP和MT6-MMP。其中MT1-MMP(即MMP14)過表達可誘導乳腺癌的形成，促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展，其他小鼠上皮癌模型也發(fā)現(xiàn)MMP14的表達，特別是在TME的腫瘤相關細胞中，且均已證實其參與了腫瘤的進展[14]。MMP14缺失的乳腺癌小鼠模型顯示轉(zhuǎn)移減少，其作用機制是基質(zhì)成纖維細胞降解Ⅰ型膠原減少[15]。

既然瘦素和MMP14均有促進乳腺癌的作用，本課題組選用MDA-MB-231乳腺癌細胞系，檢測瘦素對其MMP14表達的影響，探討其相關機制，進一步了解兩者在乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的關系。研究結(jié)果顯示，低濃度瘦素對乳腺癌細胞MMP14表達無明顯影響，100 ng/ml及以上濃度均能顯著促進MMP14蛋白表達(P<0.05)，且具有濃度依賴性。瘦素處理后，乳腺癌細胞的增殖和遷移能力均明顯升高，用ERK1/2、P38及JNK通路抑制劑分別和瘦素聯(lián)合作用細胞后，細胞的增殖和遷移能力均明顯降低(P<0.05)。用ERK1/2、P38通路抑制劑分別和瘦素聯(lián)合作用細胞后，均可顯著增加MMP14的表達水平(P<0.01)，而JNK通路抑制劑和瘦素聯(lián)合作用細胞后則顯著降低MMP14的表達水平(P<0.001)。以上結(jié)果表明，瘦素可以促進乳腺癌細胞的增殖和遷移，可能通過ERK1/2、JNK及P38通路影響乳腺癌細胞MMP14的表達，其中JNK通路在失活狀態(tài)下可下調(diào)乳腺癌細胞MMP14的表達，而ERK1/2、P38通路在失活狀態(tài)下則上調(diào)MMP14的表達，促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。有研究報道，瘦素還通過調(diào)節(jié)細胞周期蛋白D1、IGF-I、E-cadherin、血管內(nèi)皮生長因子及其受體2、P53、Survivin以及多種組織因子的表達，調(diào)節(jié)乳腺癌增殖、黏附、侵襲、遷移、炎癥和血管生成等多種重要分子的作用[3]。本研究尚有不足，例如，細胞系單一、未涉及瘦素受體的相關實驗以及基因水平，有待于進一步研究。

本研究表明，瘦素可通過對MMP14蛋白表達的調(diào)控促進乳腺癌細胞的增殖和遷移。瘦素調(diào)控MMP14的作用可通過對ERK1/2、JNK及P38這3條信號通路的關鍵信號分子調(diào)控來實現(xiàn)。本研究創(chuàng)新性地提出了瘦素與MMP14的相關性，為開發(fā)新型乳腺癌診斷與治療靶點提供實驗依據(jù)。