羅生金，蔡樹(shù)東，黃 浩

（哈密市畜牧工作站，新疆 哈密839000）

國(guó)外采用常規(guī)育種與分子標(biāo)記檢測(cè)多胎基因，1919年澳大利亞的B.Seear從新南威士州毛用型美利奴羊群中選出1只高繁殖力母羊，到1959年B.Seear的羊群已經(jīng)具有很高的繁殖力，平均產(chǎn)羔1.94只，育成了多胎的Booroola Merino高產(chǎn)群［1］。T.Wilson 等［2］發(fā) 現(xiàn)，骨 形 態(tài) 發(fā) 生 蛋 白 受 體（BMPR-IB）基因編碼區(qū)發(fā)生一處突變（A746G），導(dǎo)致該受體激酶結(jié)構(gòu)域的第249位氨基酸由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔≦→R），造成Booroola Merino綿羊排卵數(shù)增加，1989年該基因被綿羊山羊遺傳命名委員會(huì)正式定名為FecB基因。在國(guó)內(nèi)，王根林等［3］利用“forced”限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR技術(shù)，首次發(fā)現(xiàn)湖羊FecB基因與Booroola Merino綿羊的多胎主效基因FecB的表現(xiàn)型基本相同，產(chǎn)羔率為228.92%。柳淑芳等［4］利用FecB基因?qū)?guó)內(nèi)多胎品種羊進(jìn)行基因型與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析，進(jìn)一步確認(rèn)湖羊等少數(shù)品種攜帶多胎性能主效基因。試驗(yàn)以湖羊?yàn)檠芯繉?duì)象、以繁殖性狀和適應(yīng)性為重點(diǎn)選育方向，選擇杜泊羊?yàn)楦副?、湖羊?yàn)槟副緦?dǎo)入雜交，采用多胎基因和表現(xiàn)型選擇相結(jié)合方法探究FecB基因?qū)胍?guī)律，分析B基因型產(chǎn)羔數(shù)、繁殖率、抗逆性之間的關(guān)聯(lián)性，為農(nóng)區(qū)舍飼肉羊生產(chǎn)提供優(yōu)良多胎母系品種、增加養(yǎng)殖收益提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間、地點(diǎn)

2019年2—11月份，在伊州區(qū)牧緣養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社和哈密市牧祥農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社對(duì)杜泊羊和湖羊雜交F1代進(jìn)行了生產(chǎn)性能研究。FecB基因多態(tài)性由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物畜產(chǎn)樓分子遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析。

1.2 試劑與儀器

試劑包括DNA聚合酶、PCR引物、DL 2 000 DNA Marker、限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅡ、瓊脂糖；主要儀器設(shè)備包括電子天平、干熱滅菌箱、移液槍、1.5 mL離心管、自動(dòng)滅菌鍋、高速離心機(jī)、PCR儀、電泳儀、電泳槽、凝膠成像儀、恒溫?fù)u床、水浴鍋等。

1.3 試驗(yàn)動(dòng)物

在伊州區(qū)牧緣養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社選取6只杜泊羊和309只杜湖雜交羊，計(jì)315只綿羊；在哈密市牧祥農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社選取154只湖羊和295只杜湖雜交羊（其中公羔155只、母羔140只），計(jì)449只綿羊。共764只綿羊。

在牧祥農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社，對(duì)湖羊繁殖率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，對(duì)初生羔羊掛耳標(biāo)，稱(chēng)重。2周齡后給羔羊補(bǔ)料，填好產(chǎn)羔記錄，按照免疫程序進(jìn)行疫苗接種，適時(shí)母幼分飼。羔羊斷奶后抽血進(jìn)行FecB基因檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)不同基因型2.5月齡杜湖F1代羔羊成活率。

1.4 血樣的采集和基因組DNA提取

分2批次頸靜脈采集血樣，每只綿羊采集3～5 mL血樣，用裝有肝素鈉的采血器采血，將采血器上下顛倒混勻血液，以免凝固，-20℃冷凍?；蚪MDNA的提取參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（3版）中酚-氯仿抽提法對(duì)采集血樣進(jìn)行基因組DNA提取。提取步驟如下：1）將1 mL抗凝血轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管；10 000 r/min離心10 min，棄去上清液。

2）加入1 mL紅細(xì)胞裂解液充分混勻，棄去上清液；10 000 r/min離心10 min，重復(fù)上述步驟至上清液透明，沉淀接近白色。

3）加入白細(xì)胞裂解液500μL，加蛋白酶K至12μL（20 mg/mL）并混勻；加RNase A 12μL（2 mg/mL），55℃過(guò)夜，顛倒混勻2次。

4）將反應(yīng)液冷卻至室溫；加Tris-飽和酚600μL；溫和搖動(dòng)離心管10 min使其充分混勻；10 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 mL離心管中。

5）加1∶1的Tris-飽和酚/氯仿600μL，充分混和（10 min）；10 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 mL離心管中。

3.2 體育教學(xué)區(qū)別于專(zhuān)業(yè)隊(duì)的訓(xùn)練，一味的強(qiáng)調(diào)“標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)作”、“重復(fù)練習(xí)”是否能激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣？以體育活動(dòng)為載體促進(jìn)教師與學(xué)生、學(xué)生與學(xué)生的人際交往，以情感和人際吸引為基礎(chǔ)的學(xué)習(xí)平臺(tái)更能激發(fā)個(gè)體的主觀(guān)能動(dòng)性。

6）加氯仿600μL 充分混合（10 min）；10 000 r/min離心10 min；將上清液轉(zhuǎn)入另一1.5 mL離心管中。

7）加2倍體積的冰冷無(wú)水乙醇，混合轉(zhuǎn)動(dòng)離心管直至白色的絮狀沉淀析出；-20℃保存20 min。

8）13 000 r/min離心10 min；棄去上清液，用70%冰冷乙醇漂洗DNA沉淀1次。9）3 000 r/min離心2 min；棄去上清液，室溫下使乙醇揮發(fā)干凈。10）干燥后的DNA溶于50～100μL水中；4℃保存，至DNA完全溶解，-20℃保存。

1.5 FecB基因多態(tài)性檢測(cè)

首先用FecB基因檢測(cè)引物對(duì)提取的DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，然后用限制性?xún)?nèi)切酶AvaⅡ?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，進(jìn)行限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)（RFLP）分析（由新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)生物畜產(chǎn)樓分子遺傳實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行分析）。

FecB基因檢測(cè)引物序列：F 5′-GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG -3′，R 5′-CAAGATGTTTTCATGCCTCATCAACACGGTC-3′，擴(kuò)增片段大小為140 bp。PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)體系 μL

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；60℃退火30 s；72℃延伸30 s；共33個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保存。用1×TAE電泳緩沖液配制2%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL EB）。取PCR產(chǎn)物4μL，混合1μL 5×Loading Buffer上樣，以DL 2 000 DNA Marker進(jìn)行分子質(zhì)量對(duì)照。用1×TAE電泳緩沖液，在電壓80 V、電流90 mA條件下電泳40 min。凝膠自動(dòng)成像儀或紫外透射儀下觀(guān)察結(jié)果，檢測(cè)目的條帶純度及亮度，判斷結(jié)果。

酶切反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

表2 酶切反應(yīng)體系 μL

酶切反應(yīng)程序：37℃水浴4 h，用1×TAE電泳緩沖液配制3.3%瓊脂糖凝膠（含0.5μg/mL EB）。取酶切產(chǎn)物10μL，混合1μL 5×Loading Buffer上樣，以DL 2 000 DNA Marker進(jìn)行分子質(zhì)量對(duì)照，

以1×TAE電泳緩沖液，在電壓80 V、電流90 mA條件下電泳40 min。在凝膠自動(dòng)成像儀或紫外透射儀下觀(guān)察，判斷結(jié)果。

1.6 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析

采用SPSS 19.0、Excel軟件對(duì)基因型頻率、等位基因頻率、多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，分析重（雜）合度與產(chǎn)羔率、羔羊成活率之間的關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 FecB基因PCR擴(kuò)增

用PCR引物對(duì)FecB基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。通過(guò)電泳檢測(cè)可見(jiàn)月140 bp大小的片段，且無(wú)目的片段以外的雜條帶，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 FecB基因RFLP檢測(cè)

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行RFLP檢測(cè)，利用AvaⅡ限制性?xún)?nèi)切酶對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在37℃水浴4 h進(jìn)行酶切，酶切后用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖2。FecB基因存在3種基因型，其中僅為140 bp片段的為野生型純合子++基因型，僅為110 bp片段的為突變純合子BB基因型，140 bp和110 bp片段同時(shí)存在的為突變雜合子B+基因型。

2.3 群體遺傳測(cè)定

通過(guò)對(duì)764只綿羊的FecB基因進(jìn)行PCRRFLP檢測(cè)，并對(duì)FecB基因的基因型頻率和等位基因頻率進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：杜湖雜交羊產(chǎn)生3種基因型（++、B+、BB），其中++基因型為野生純合子，B+基因型為突變雜合子，BB基因型為突變純合子。牧緣養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社的杜湖雜交羊群體中+等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，等位基因頻率為0.59，杜泊羊等位基因頻率為0.50，見(jiàn)表3；牧祥農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社湖羊群體中B等位基因?yàn)閮?yōu)勢(shì)等位基因，等位基因頻率為0.526，而杜湖雜交羊群體中+等位基因?yàn)槿詾閮?yōu)勢(shì)等位基因，等位基因頻率為0.575，見(jiàn)表4。

表3 牧緣養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社羊群體FecB基因的基因型頻率和等位基因頻率

表4 牧祥農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社羊群體FecB基因的基因型頻率和等位基因頻率

2.4 多態(tài)性位點(diǎn)分析

對(duì)試驗(yàn)羊群FecB基因多態(tài)位點(diǎn)遺傳參數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明，牧緣養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社試驗(yàn)羊群中FecB基因在杜湖雜交羊中存在多態(tài)性，杜湖雜交羊、杜泊羊FecB基因的多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.368，0.305，屬于中度多態(tài)位點(diǎn)（見(jiàn)表5）。牧祥農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社試驗(yàn)羊群中FecB基因在杜湖雜交羊中存在多態(tài)性，湖羊、杜湖雜交羊FecB基因的PIC為0.374，0.369，均屬于中度多態(tài)位點(diǎn)（見(jiàn)表6）。

表5 牧緣養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社羊群體FecB基因的基因純合度、雜合度

表6 牧祥養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社羊群體FecB基因的基因純合度、雜合度

2.5 產(chǎn)羔率

在階段性試驗(yàn)中初步建立了杜湖F1代公、母后備羊群，牧祥合作社不同F(xiàn)ecB基因湖羊×杜泊羊F1代產(chǎn)羔數(shù)見(jiàn)表7。

表7 牧祥養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社杜湖雜交羊產(chǎn)羔數(shù)測(cè)定結(jié)果

154只湖羊產(chǎn)羔334只，其中BB基因型52只母羊產(chǎn)羔139只，產(chǎn)羔率為267%；B+基因型58只母羊產(chǎn)羔135只，產(chǎn)羔率為233%；++基因型44只母羊產(chǎn)羔60只，產(chǎn)羔率為136%；BB基因型母羊產(chǎn)羔率比B+型母羊提高了34百分點(diǎn)，差異顯著（P＜0.05），基因型為BB型、B+型的母羊產(chǎn)羔率比++型母羊分別提高了131，97百分點(diǎn)，差異極顯著（P＜0.01）。說(shuō)明多胎基因FecB分子標(biāo)記技術(shù)可以用于對(duì)綿羊產(chǎn)羔數(shù)的輔助選擇。

2.6 羔羊成活率

階段性試驗(yàn)中觀(guān)察到，大多數(shù)患有肺炎的羔羊或產(chǎn)羔在3個(gè)以上的體弱羔羊死亡。牧祥養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社不同F(xiàn)ecB基因湖羊成活率比較見(jiàn)表8。

表8 牧祥養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社杜湖雜交羊成活率比較

由表8可以看出，BB基因型母羊產(chǎn)羔成活率為84.2%，B+基因型為89.6%，++基因型為95.0%，BB基因型與B+基因型差異不顯著（P＞0.05），BB基因型與++基因型相比差異顯著（P＜0.05）。說(shuō)明隨著羔羊數(shù)增多，死亡率有所增加。杜湖雜交羔羊哺乳期總體成活率高達(dá)88.3%（295/334），較牧祥合作社以往湖羊純繁羔羊成活率（73.0%）提高了15.3百分點(diǎn)。

3 討論

1）綿羊多胎基因（FecB）的位點(diǎn)被定位在第6號(hào)染色體上，具有增加排卵和產(chǎn)羔數(shù)的生物學(xué)作用。張利平［5-6］以小尾寒羊、蒙古羊、無(wú)角陶塞特羊作為研究對(duì)象進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，F(xiàn)ecB基因可作為小尾寒羊的多胎分子標(biāo)記。王根林等［7］以12只湖羊、12只小尾寒羊和12只新疆細(xì)毛羊?yàn)檠芯繉?duì)象，利用“forced”限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR技術(shù)（RFLP-PCR）檢測(cè)是否存在FecB基因。結(jié)果表明：12只湖羊均為純合型FecB基因攜帶者；12只小尾寒羊中4頭為純合型FecB基因攜帶者，7只為雜合型，1只不攜帶FecB基因；而12只新疆細(xì)毛羊均不攜帶FecB基因。A.K.Mishra等［8］將攜帶FecB基因的卡羅爾羊與馬爾普拉羊進(jìn)行雜交，并應(yīng)用RFLP-PCR技術(shù)對(duì)雜交F1代進(jìn)行鑒定篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，攜帶B+基因的母羊中有55%的產(chǎn)了多羔，且雜交F1代中78.4%的羔羊攜帶B+基因型。李達(dá)等［9］為驗(yàn)證FecB基因?yàn)榫d羊高繁殖力主效基因，應(yīng)用SSCP-PCR和RFLPPCR技術(shù)對(duì)4種綿羊FecB基因進(jìn)行單核苷酸多態(tài)性檢測(cè)分析，結(jié)果表明，SSCP-PCR和RFLPPCR技術(shù)均能準(zhǔn)確判型，穩(wěn)定性和可靠性良好，且判斷結(jié)果一致；檢測(cè)還發(fā)現(xiàn)4種綿羊均攜帶FecB突變，且能證明FecB基因?yàn)榫d羊高繁殖力主效基因。柏雪梅等［10］為探討策勒黑羊和多浪羊FecB基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的相關(guān)性，利用PCRRFLP技術(shù)對(duì)這兩品種綿羊FecB基因單核苷酸多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)研究該基因?qū)Ξa(chǎn)羔數(shù)的影響。結(jié)果表明：策勒黑羊和多浪羊FecB基因具有多態(tài)性，基因型為BB型的策勒黑羊平均產(chǎn)羔數(shù)為2.87只/胎，顯著高于++型（P＜0.05）；基因型為B+型的多浪羊平均產(chǎn)羔數(shù)為2.55只/胎，顯著高于++型（P＜0.05），與本研究結(jié)論一致。

2）湖羊具有耐高溫高濕、適應(yīng)舍飼、四季發(fā)情、繁殖力高等優(yōu)良性狀，是我國(guó)著名的多羔綿羊品種，近年來(lái)在全國(guó)廣泛推廣。哈密市引入的湖羊在飼養(yǎng)中易出現(xiàn)高熱、咳嗽等呼吸道癥狀，部分母羊妊娠后繁殖率高，但羔羊體質(zhì)差，體格偏小，生長(zhǎng)緩慢，抵抗力弱，死亡率高，母羊流產(chǎn)率也較高。為了進(jìn)一步提高湖羊F1代生產(chǎn)性能，2016年哈密市從澳大利亞引入了生長(zhǎng)發(fā)育快、胴體瘦肉率高、耐粗飼、抗逆性強(qiáng)的黑頭杜泊羊，與湖羊進(jìn)行雜交改良試驗(yàn)。結(jié)果表明，在牧緣、牧祥養(yǎng)殖專(zhuān)業(yè)合作社以湖羊?yàn)槟副尽⒍挪囱驗(yàn)楦副镜亩藕s交F1代羊存在多態(tài)性，PIC分別為0.368，0.369，均屬于中度多態(tài)位點(diǎn)，BB型基因、B+型基因均有較高的產(chǎn)羔率（267%、233%）；BB型基因、B+型基因斷奶成活率分別為84.2%、89.6%，BB型基因產(chǎn)羔數(shù)增加，但相對(duì)成活率較低，需要進(jìn)一步加強(qiáng)飼養(yǎng)管理。

4 結(jié)論

湖羊、杜泊羊、杜湖雜交F1代羊FecB基因多態(tài)性及產(chǎn)羔數(shù)和成活率測(cè)定結(jié)果表明，B型基因?yàn)槎嗵ブ餍Щ颍軌蛴行岣吣秆蚍敝陈省?/p>