李豐田，趙艷嬌，張曉鷹，白文林，黨云龍，郭 丹*

（1.遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心，遼寧 遼陽111000；2.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，沈陽110866）

遼寧絨山羊原產(chǎn)于遼寧省東南部山區(qū)，是我國絨山羊品種中產(chǎn)絨量最高的優(yōu)良品種，屬絨肉兼用型品種［1］。遼寧省畜牧科學(xué)研究院新培育的遼寧絨山羊絨肉兼用新品系種羊具有體格高大、遺傳性能穩(wěn)定、生長速度快等優(yōu)勢(shì)［2］。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，對(duì)參與肌肉生長發(fā)育過程基因的研究越來越深入。關(guān)于肌肉的生長發(fā)育機(jī)制，國內(nèi)外的研究主要集中在基因?qū)τ诩∪饧?xì)胞的調(diào)控表達(dá)等方面［3］。胰島素樣生長因子（IGF2基因）作為調(diào)控肌肉生長發(fā)育的主效基因，對(duì)遼寧絨山羊肌肉細(xì)胞的生長分化起到關(guān)鍵的調(diào)控作用［4］。文章從分子生物學(xué)的角度闡述了IGF2對(duì)遼寧絨山羊肌肉生長發(fā)育的調(diào)節(jié)，為遼寧絨山羊“絨肉兼用”品系分子育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

遼寧絨山羊健康成年公羊13只，由遼寧省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)基地建設(shè)工程中心畜牧業(yè)生產(chǎn)加工流通部提供。

1.2 總RNA的提取

對(duì)遼寧絨山羊7種不同組織的總RNA采用TRIzol法進(jìn)行提取。提取后的RNA使用RNAfree Dnase I（TaKaRa，大連）處理，避免產(chǎn)生污染。

1.3 總RNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

總RNA反轉(zhuǎn)錄體系：PrimeScript RT Enzyme Mix 2μL，RT Primer Mix 2μL，PrimeScript Buffer 2 8μL，RNase Free Dh 208μL。PCR反應(yīng)程序：37℃15 min，85℃5 s，4℃5 min。后將合成的cDNA于-20℃冷凍保存，備用。

1.4 定量PCR

以NCBI公布的山羊IGF2的編碼區(qū)序列（GenBankNM_001287041.1）為參考設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)遼寧絨山羊的IGF2基因5′調(diào)控區(qū)和編碼區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，引物序列見表1。

表1 IGF2基因擴(kuò)增引物序列及退火溫度

1.5 不同物種序列信息及比對(duì)分析

測(cè)序結(jié)果采用DNAMan 6.0生物軟件進(jìn)行拼接，得到最終目的序列。將目的序列與GenBank中不同物種的相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，確定基因序列結(jié)構(gòu)。 然后利用DNAStar、DNAMan 6.0、MEGA 7.0、BLAST、BioEdit、SOPMA、Methprimer等軟件與GenBank中其他物種的序列進(jìn)行比較分析。從GenBank中獲取的部分動(dòng)物IGF2基因編碼區(qū)的信息見表2，用于物種間序列的比對(duì)分析。

表2 部分動(dòng)物的IGF2基因編碼區(qū)的基本信息

2 結(jié)果與分析

2.1 IGF2基因突變類型及位置

經(jīng)過分析發(fā)現(xiàn)，用特異性設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增的遼寧絨山羊IGF2基因序列長2 090 bp，包括5′調(diào)控區(qū)、編碼區(qū)，編碼區(qū)長540 bp。將克隆出的遼寧絨山羊序列與山羊序列進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，第263 bp處發(fā)生A/T突變，974位發(fā)生堿基缺失突變，A缺失。

2.2 不同物種的IGF2基因分子進(jìn)化關(guān)系

將克隆出的遼寧絨山羊IGF2序列與其他動(dòng)物進(jìn)行對(duì)比分析，遼寧絨山羊與山羊的同源性高達(dá)99.8%，與其他物種相比IGF2基因的同源性分別是綿羊99.0%、樂至黑山羊99.0%、黃牛98.0%、牦牛97.0%、水牛98.0%、豬93.0%、馬91.0%。通過以上動(dòng)物之間的比對(duì)發(fā)現(xiàn)，作為調(diào)控肌肉生長發(fā)育的基因，IGF2在部分偶蹄目動(dòng)物和奇蹄目動(dòng)物中不僅是在物種內(nèi)高度保守，在種間也同樣高度保守，在進(jìn)化過程中趨于穩(wěn)定。

采用NJ法構(gòu)建包括遼寧絨山羊在內(nèi)的部分物種的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹（見圖1）和親緣關(guān)系（見圖2）。

整個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹有三個(gè)明顯的大分支：第一類分支包括遼寧絨山羊、藏山羊。樂至黑山羊、山羊、綿羊、黃牛和牦牛均是偶蹄目反芻動(dòng)物。遼寧絨山羊和藏山羊、樂至黑山羊、山羊均屬于同一分支且遺傳距離非常接近，與綿羊遺傳距離略有差異，但均屬于同一分支。黃牛和牦牛有著較近的遺傳距離，屬第一類分支的一類小分支。而豬和馬分別構(gòu)成了第二類和第三類大分支。遼寧絨山羊和藏山羊從生產(chǎn)性能上均屬于產(chǎn)絨型山羊，按照傳統(tǒng)的系統(tǒng)分類法屬于同一類物種，這個(gè)聚類結(jié)果與傳統(tǒng)的生物學(xué)系統(tǒng)分類法基本一致。

2.3 mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)生物信息學(xué)特征

通過在線網(wǎng)站RNAfold WebServer分析遼寧絨山羊IGF2基因mRNA序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)。IGF2基因序列最優(yōu)堿基對(duì)二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能為-3 096.13 J/mol，二級(jí)結(jié)構(gòu)中心結(jié)構(gòu)的最小自由能為-2 125.82 J/mol，總體結(jié)構(gòu)的自由能熵為-3 212.33 J/mol，整體多樣性指標(biāo)為476.16。

2.4 IGF2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)特征

對(duì)遼寧絨山羊IGF2編碼區(qū)總長度進(jìn)行開放閱讀框的分析，編碼區(qū)總長度為540 bp，共編碼179個(gè)氨基酸，其構(gòu)成及比例見表3。

表3 遼寧絨山羊IGF2基因編碼區(qū)氨基酸組成

經(jīng)過ExPASy-ProtParam分析結(jié)果表明，IGF2基因編碼蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為19 654.41，等電點(diǎn)為8.84。序列中Ala使用頻率最高，頻率為11.7%，其次是Leu，使用頻率為10.6%；其他氨基酸使用頻率為0.6%～10.1%；Pyl和Sec均沒有使用。負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)為19個(gè)，正電荷氨基酸殘基總數(shù)為24個(gè)，原子組成為860個(gè)碳原子、1 364個(gè)氫原子、250個(gè)氮原子、258個(gè)氧原子、10個(gè)硫原子。根據(jù)軟件預(yù)測(cè)，其體外半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為62.91（大于40為不穩(wěn)定蛋白），脂肪族氨基酸指數(shù)為73.18，其蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總和為-0.220，說明遼寧絨山羊IGF2編碼蛋白質(zhì)疏水性較弱且不穩(wěn)定。

2.5 對(duì)遼寧絨山羊IGF2的啟動(dòng)子區(qū)的CpG島進(jìn)行預(yù)測(cè)

遼寧絨山羊IGF2基因序列在-317，-883，-963，-1 908 bp處可能存在潛在啟動(dòng)子序列，在-1 921 bp處僅發(fā)現(xiàn)1個(gè)TAT-box。

利用Methprimer在線分析IGF2的CpG島，發(fā)現(xiàn)IGF2基因5′調(diào)控區(qū)存在明顯的飾CpG島。島區(qū)域GC含量大于50%，長度超過100 bp。這種GC含量的差異性對(duì)IGF2基因表達(dá)以及調(diào)控、基因突變都可能起著很重要的作用。IGF2的5′調(diào)控區(qū)有3個(gè)CpG島，分別在-22～-839 bp、-867～-177 bp、-1 175～-1 773 bp處，大小分別為818，305，599 bp。基因轉(zhuǎn)錄必備條件之一是啟動(dòng)子區(qū)中的CPG島處于未甲基化狀態(tài)，而CpG序列中C的甲基化有可能導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄水平受到抑制。說明該CpG島區(qū)域?qū)GF2的基因表達(dá)有著重要作用。

2.6 IGF2信號(hào)肽預(yù)測(cè)

根據(jù)IGF2蛋白質(zhì)信號(hào)肽分析發(fā)現(xiàn)，存在明顯的信號(hào)肽序列，在第24和25氨基酸之間的C值最大，信號(hào)肽切割概率為45%。S值是蛋白質(zhì)序列信號(hào)肽區(qū)域與其他區(qū)域的評(píng)估值，高分值區(qū)域是信號(hào)肽切割位點(diǎn)前的區(qū)域，而低分值區(qū)域是信號(hào)肽切割位點(diǎn)后大約30個(gè)氨基酸殘基區(qū)域或者是非分泌蛋白的N-末端區(qū)域。Mature Chain Sequence預(yù)測(cè)位置在19～179 bp處，屬于分泌性蛋白，判斷遼寧絨山羊的IGF2基因存在信號(hào)肽序列。

2.7 IGF2編碼蛋白疏水區(qū)

對(duì)遼寧絨山羊IGF2基因編碼的179個(gè)氨基酸的蛋白成熟序列進(jìn)行疏水區(qū)預(yù)測(cè)，遼寧絨山羊IGF2基因編碼蛋白的而C端有一定的疏水性，N端具很強(qiáng)親水性，位于分子內(nèi)部；中間部分親水性較強(qiáng)。從總體上講，該蛋白的親水性比疏水性強(qiáng)，而疏水區(qū)相對(duì)較少。推測(cè)這些親水區(qū)對(duì)IGF2蛋白形成重要的功能結(jié)構(gòu)域發(fā)揮一定的作用［5］。

2.8 IGF2編碼蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域的預(yù)測(cè)

對(duì)遼寧絨山羊IGF2編碼蛋白的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)。在179個(gè)氨基酸殘基組成的IGF2編碼蛋白的序列中，存在67個(gè)氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄生長因子前肽超家族的基序以及56個(gè)氨基酸殘基組成的轉(zhuǎn)錄生長因子超家族的基序，都有很高的保守性。

2.9 IGF2蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過在線軟件SOPMA對(duì)IGF2編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：序列預(yù)測(cè)圖中IGF2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中主要是由38.50%α螺旋（h）、11.73%伸展鏈（e）、11.17%β轉(zhuǎn)角（t）和38.55%隨機(jī)線圈螺旋（c）組成。從氨基酸的對(duì)應(yīng)序列可以看出，整個(gè)蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了2個(gè)大峰，可見α螺旋結(jié)構(gòu)出現(xiàn)的集中區(qū)域相對(duì)比較明顯。

2.10 IGF2蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

將測(cè)序推導(dǎo)出的含有179個(gè)氨基酸殘基的遼寧絨山羊IGF2基因編碼的蛋白序列，用SWISSMODEL軟件進(jìn)行同源性搜索，利用高同源性建立三維結(jié)構(gòu)模板。結(jié)果表明：與遼寧絨山羊IGF2蛋白同源性最高的是蛋白因子D11 bound IGF-II（5131.1.A）同源性達(dá)到94.03%。基于5131.1.A的三維結(jié)構(gòu)建立三維結(jié)構(gòu)模型，其含有多個(gè)α螺旋結(jié)構(gòu)域，該三維空間結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

3 結(jié)論

遼寧絨山羊IGF2基因編碼區(qū)序列總長度為540 bp?？寺⌒蛄兄械?63 bp處發(fā)生A/T突變，974位發(fā)生A堿基缺失突變。通過不同物種之間的親緣關(guān)系進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，IGF2基因在物種之間是比較保守的，不同目之間的也有80%以上的相似度。對(duì)IGF2的啟動(dòng)子序列和CpG島進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)IGF2僅含有一個(gè)TATA-box，3個(gè)CpG島；并預(yù)測(cè)了mRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)的化學(xué)性質(zhì)。利用軟件對(duì)IGF2的信號(hào)肽和蛋白質(zhì)親水性進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，IGF2有信號(hào)肽序列，屬于分泌蛋白。IGF2基因編碼179個(gè)氨基酸序列，構(gòu)成的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量是19 654.41。對(duì)其二級(jí)結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)其固定的結(jié)構(gòu)域具有高度保守的特點(diǎn)，并預(yù)測(cè)了三維結(jié)構(gòu)。