吳 昊，崔緒代，李云翔，楊 海，張金龍，張效生，馬文奎，張 魯，韓紅兵，吳英杰，劉海軍，袁三平，連正興，劉國世*

（1.中國農業(yè)大學 動物科技學院，北京100193；2.青島森淼實業(yè)有限公司，山東 青島266101；3.天津市畜牧獸醫(yī)研究所，天津300192）

隨著分子生物學技術的快速發(fā)展，以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術迅速發(fā)展，逐漸滲透到工業(yè)、農業(yè)、醫(yī)藥領域［1-2］。轉基因技術可以加快畜牧品種遺傳改良，提高畜產品肉、蛋、奶生產性能［3］。中國農業(yè)大學李寧課題組、劉國世課題組利用體細胞核移植技術先后生產出轉綠色熒光蛋白奶牛和轉AANAT基因奶山羊［4-5］。隨著轉基因技術的快速發(fā)展及其產品的市場化，轉基因生物安全被廣泛關注，世界各國政府與機構相繼制定相應的法律法規(guī)和安全評價體系來規(guī)范轉基因生物的研究與應用［6］。

褪黑素（melatonin，MT），是一種主要由松果體分泌的重要神經生殖激素，具有強抗氧化性，能夠抗衰老、抗腫瘤，參與機體免疫調節(jié)［7-10］。線粒體是合成褪黑素的主要場所［11］，芳烷基胺N-乙酰轉移酶（AANAT）［12］及乙酰血清素甲基轉移酶（ASMT，HIOMT）［13］是褪黑素合成過程中的限速酶。在動物體內色氨酸（Try）經過羥化、脫羧、乙?；图谆牟胶铣赏屎谒兀?4］。褪黑素能提高機體免疫力，抗衰老，具有巨大的醫(yī)藥和商業(yè)價值。E.Magnanou等［15］給中麝鼠句持續(xù)補充外源褪黑素，其壽命得到延長。A.Jenwitheesuk等［16］、ZHANG L.等［17］發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可以延緩小鼠機體及生殖機能衰老。TAO J.等［18］發(fā)現(xiàn)，血液中高水平的褪黑素能夠提高克隆奶山羊機體免疫能力。目前，國內外有很多褪黑素類產品，例如：“Night Milk”、“Slumber Bedtime Milk”、腦白金等，這些產品的功能主要是調節(jié)睡眠、提高機體免疫力［19］。褪黑素類功能產品將是未來開發(fā)熱點，研發(fā)褪黑素乳腺生物反應器在家畜育種及構建醫(yī)藥動物模型中具有重要意義。

為了研發(fā)褪黑素乳腺生物反應器，試驗針對用原核胚微注射技術生產的乳腺過表達ASMT基因嶗山奶山羊動物模型，對過表達ASMT基因品質性狀改良的奶山羊進行安全評價，以期為培育轉基因家畜新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗山羊為青島森淼試驗有限公司試驗基地的成年轉基因嶗山奶山羊群體（n=13）。所涉及轉基因試驗樣本為褪黑素合成酶基因ASMT乳腺特異性表達的轉基因奶山羊（圖中簡稱“陽性”）10只，對照羊（圖中簡稱“對照”）3只。

1.2 試驗試劑

PCRMIX、DHA提取試劑盒、100 bp和1 kb Marker，均購自天根生化科技（北京）有限公司；Agrose，購自北京賽百盛生物技術發(fā)展中心；DHI測定儀（型號為MilkoScanTMFT1），購自丹麥福斯集團公司。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 轉基因陽性羊的鑒定 用采樣鉗采集原核注射轉基因羊耳樣，采用試劑盒提取耳樣DNA，測定DNA質量。PCR擴增程序：95℃預變性3 min；95℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72℃7 min后，4℃存放。擴增引物信息見表1。

表1 ASMT基因PCR擴增引物序列及長度

1.3.2 生長性能、體溫、乳成分和血液指標的測定

分別于初生、3月齡、6月齡、12月齡時用卷尺測定羊體重、體長、體高和胸圍等體尺數(shù)據(jù)，并在同一天07：00、12：00、19：00用水銀溫度計測定羊肛門溫度。母羊產仔泌乳7 d后連續(xù)3 d收集乳汁，每天分別于04：00和16：00收集顏色、氣味、黏度正常的乳汁（每次5 mL），同時靜脈采血（5 mL抗凝集管收集分離血漿，-20℃避光保存）。膽固醇等6項血液生化指標、單核細胞數(shù)等7項血液生理指標和紅細胞數(shù)等7項血液紅細胞指標在青島農業(yè)大學動物醫(yī)院測定，乳中體細胞數(shù)及乳蛋白等6項乳品質指標在全國奶牛生產性能測定標準物質制備實驗室用DHI測定儀測定。

1.3.3 尿液、糞樣指標的測定 將羊只保定，注射獸用呋塞米注射液針劑促進排尿，清洗尿道口，用15 mL離心管收集3～5 mL尿液，冰上保存。白細胞數(shù)等7項尿液相關指標由青島農業(yè)大學動物醫(yī)院檢測。給羊只清洗肛門后，在手套上涂抹凡士林，手指從肛門進入直腸。取直腸處糞樣，用液氮速凍后用干冰運輸，送至金唯智生物科技有限公司進行16SrDNA微生物菌群測序。

1.3.4 褪黑素濃度的測定 用高效液相色譜法測定乳中和血液中褪黑素含量。

1.4 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS軟件進行統(tǒng)計分析，采用LSD檢驗進行兩者之間的比較，以P ＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 轉基因羊陽性驗證

轉基因奶山羊DNA樣品進行PCR擴增后，擴增產物進行1% 瓊脂糖凝膠電泳，ASMT基因比對結果見圖1。

由圖1A可知，轉基因奶山羊ASMT基因陽性擴增片段大小為507 bp，片段大小與預期目的片段大小一致。目標片段切膠回收后測序。圖1B的測序結果與GenBank數(shù)據(jù)庫中ASMTmRNA（KC 290 950.1）收錄序列相似度達99.77%。圖1C的測序結果與載體PBC1-ASMT序列比對，相似度為99.01%。共獲得乳腺特異表達ASMT基因陽性羊10只，其中公羊6只、母羊4只。

2.2 奶山羊生長性能

轉基因奶山羊分別于出生、3月齡、6月齡和12月齡測定體重、體長、身高和胸圍等體尺數(shù)據(jù)，結果見圖2。

由圖2可知，轉基因陽性奶山羊（n=10）的生長性能與對照羊（n=10）均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3 奶山羊體溫及血液生理生化指標

2.3.1 奶山羊體溫及血液生化四項指標 測定結果見圖3。

由圖3可知，轉基因陽性奶山羊（n=10）和對照羊（n=3）日體溫無顯著差異（P＞0.05），膽固醇、血糖、總蛋白、白蛋白、球蛋白含量也均無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.2 奶山羊血液生理指標及紅細胞相關指標參數(shù) 測定結果見圖4、圖5。

由圖4可知，轉基因陽性羊與對照羊血液各項生理指標無顯著差異（P＞0.05）

由圖5可知，轉基因陽性羊血液紅細胞相關各項指標與對照羊無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.3 奶山羊尿液生理指標 檢測結果見表2。

由表2可知，兩組奶山羊尿液中白細胞、蛋白質、葡萄糖、酮體、尿膽元、膽紅素、潛血檢測結果均為陰性。

表2 奶山羊尿液生理指標測定結果

2.4 奶山羊微生物指標

采集轉基因陽性羊（n=10）和對照羊（n=3）直腸段糞便后液氮速凍，送金維智生物科技有限公司進行16S微生物測序，共產生633 MB原始數(shù)據(jù)，有效數(shù)據(jù)為540 MB，見圖6。

圖6A為在綱的水平上測序物種分布柱狀圖，轉基因陽性羊與對照羊在綱水平微生物均為17種，圖6B為測序不同個體之間微生物種類距離矩陣熱圖。由圖6可知，轉基因奶山羊和對照羊糞樣菌種組成和優(yōu)勢菌群無顯著差異（P＞0.05）。

2.5 奶山羊褪黑素產量分析

測定結果見圖7。

由圖7可知：轉基因陽性羊04：00時乳中褪黑素含量顯著高于對照羊［（51.44±1.05）ng/mL vs（45.63±0.88）ng/mL，P＜0.05］，16：00時乳中褪黑素含量也顯著高于對照羊［（46.49±0.93）ng/mL vs（33.60±1.47）ng/mL，P＜0.05］。08：00時轉基因陽性羊乳中褪黑素含量顯著高于血液［（48.53±1.27）ng/mL vs（40.04±2.57）ng/mL，P＜0.05］，對照組血液和乳中褪黑素含量無顯著差異［（38.79±2.19）ng/mL vs（37.56±2.28）ng/mL，P＞0.05］。

2.6 奶山羊乳品質

測定結果見圖8。

由圖8可知：轉基因陽性羊和對照羊乳糖含量、乳脂含量、非脂乳固體含量、尿素氮含量均無顯著差異（P＞0.05）；轉基因陽性羊乳蛋白含量、干物質含量顯著高于對照羊（P＜0.05），陽性羊體細胞數(shù)顯著低于對照羊（P＜0.05）。說明乳腺過表達ASMT基因嶗山奶山羊乳成分發(fā)生改變，乳品質得到提升。

3 討論

轉基因技術不僅僅涉及科研，更涉及醫(yī)藥衛(wèi)生、工業(yè)、農業(yè)等領域，而轉基因安全話題早已走進千家萬戶。農業(yè)轉基因在提高農作物及畜牧業(yè)育種效率、改良農作物及畜牧品種品質方面發(fā)揮著重要作用［20］。開展農業(yè)轉基因生物研究是我國著眼于長久發(fā)展、推動自主創(chuàng)新的戰(zhàn)略決策［21］。目前全球基本形成了轉基因生物安全評價的體系框架，主要是關注新表達的蛋白質和其他新成分和可能的變化對機體及環(huán)境造成的影響［22］。2003年7月1日，國際食品法典委員會（CAC）通過了現(xiàn)代生物技術食品風險分析原則、重組DNA植物食品安全評估準則、重組DNA 微生物食品安全評估準則［23-24］。綜合國內外情況，我國建立了相關法律法規(guī)和技術管理規(guī)程，包括轉基因研究、試驗、生產、加工等環(huán)節(jié)［25］。國務院頒布了《農業(yè)轉基因生物安全管理條例》，原農業(yè)部制定實施了《農業(yè)轉基因生物安全評價管理辦法》《農業(yè)轉基因生物進口安全管理辦法》《農業(yè)轉基因生物標識管理辦法》和《農業(yè)轉基因生物加工審批辦法》四個配套規(guī)章，國家質檢總局施行了《進出境轉基因產品檢驗檢疫管理辦法》［26］。

本研究以原核胚顯微注射技術生產的過表達褪黑素合成酶ASMT基因嶗山奶山羊為研究對象，跟蹤其生長發(fā)育情況，評價其生物安全性。K.Jackson等［27］對轉人類溶菌酶基因山羊的生長發(fā)育數(shù)據(jù)總結表明，轉人溶菌酶基因山羊生長特性與普通山羊無顯著差異。本研究也分析了轉褪黑素合成酶ASMT基因嶗山奶山羊的體重、體長、體高、胸圍等體尺數(shù)據(jù)，同樣沒有發(fā)現(xiàn)顯著變化，這說明轉ASMT基因不影響奶山羊正常發(fā)育速率。體溫異常可能預示著某些代謝疫?。?8］。轉基因奶山羊日體溫變化并無異常，這說明轉基因奶山羊新陳代謝正常。血液生理生化參數(shù)是健康體況的重要衡量指標，反映機體代謝、營養(yǎng)和疾病情況［29］。本試驗還測定了轉ASMT基因陽性羊的膽固醇、血糖、白蛋白、球蛋白等血液生化指標，單核細胞含量、淋巴細胞含量、白細胞含量、中性粒細胞含量等血液生理指標，這些指標與對照羊均沒有顯著差異。紅細胞是運輸氧氣的主要載體，同時還具有免疫功能，紅細胞指標反映了呼吸等功能的健康狀況［30］。本研究通過測定轉基因羊血液中紅細胞含量、血紅蛋白含量、紅細胞壓積、紅細胞寬度等指標發(fā)現(xiàn)，過表達ASMT基因并沒有對紅細胞功能造成損害。

機體內有正常的微生物群落，腸道微生物變異影響機體自身健康［31］。對轉化編碼乳鐵蛋白的轉基因奶牛進行了牛腸道和土壤中微生物群落16S rDNA測序，結果表明，轉基因對牛腸道或土壤中的微生物群落沒有影響［32］。同樣對轉ASMT基因奶山羊的腸道微生物進行了16S rDNA測序，發(fā)現(xiàn)其腸道微生物群落組成和優(yōu)勢菌群并無顯著變化。DHI指標參數(shù)能夠反映乳品質［33］。通過DHI測定發(fā)現(xiàn)，轉基因陽性羊乳蛋白和干物質含量顯著高于對照羊（P＜0.05），而體細胞數(shù)顯著低于對照羊（P＜0.05），這表明轉基因陽性羊的乳品質得到了一定程度改善。與此同時，乳中褪黑素含量明顯高于血液，這說明乳腺過表達ASMT基因后乳中褪黑素含量得到提高。體內高褪黑素含量可提高機體抗炎能力［34］，從而降低體細胞數(shù)，這與外源褪黑素可以降低奶牛體細胞數(shù)研究結果一致［35］。

ASMT基因插入序列是山羊體內基因克隆而來。羊自身分泌催乳素誘導山羊酪蛋白啟動子啟動表達ASMT基因，在山羊乳腺細胞中催化5-羥色胺（5-HT）合成褪黑素。該轉基因過程并沒有引入外源基因，只是單純地增加了羊自身基因的拷貝數(shù)，未產生毒性及變異蛋白，避免了基因漂流引起的生物安全。

4 結論

乳腺過表達ASMT基因陽性奶山羊與對照羊在生長性能，血液、尿液生理生化指標及糞便微生物組成等指標上無顯著差異。轉基因陽性羊乳中干物質和乳蛋白含量、褪黑素含量顯著高于對照羊，而乳中體細胞數(shù)降低，乳品質得到提高。