張 珊,陳忠偉,孟詩敏,丁慶林,鐘自彪,魏艷紅,葉啟發(fā),胡康洪

張珊,陳忠偉,孟詩敏,丁慶林,魏艷紅,胡康洪,湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院湖北省工業(yè)微生物重點實驗室中德生物醫(yī)學(xué)中心 教育部及國家外專局“細胞調(diào)控與分子藥物學(xué)科111創(chuàng)新引智基地” 湖北省武漢市 430068

鐘自彪,葉啟發(fā),武漢大學(xué)肝膽疾病研究院 武漢大學(xué)中南醫(yī)院 湖北省武漢市 430071

0 引言

據(jù)國際癌癥研究機構(gòu)統(tǒng)計,原發(fā)性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)是全世界致死率高居第二位的惡性腫瘤,在我國發(fā)病率僅次于肺癌和胃癌[1].HCC惡性程度高,浸潤和轉(zhuǎn)移性強,發(fā)病時癥狀隱匿.在多數(shù)情況下,HCC在中晚期才被診斷出來,并且HCC患者的預(yù)后較差,其5年生存率不到5%.傳統(tǒng)治療手段包括手術(shù)切除、肝移植、經(jīng)導(dǎo)管動脈化學(xué)栓塞、放化療等,治療效果和預(yù)后欠佳.因此,急切需要尋找藥物干預(yù)新靶點,用于肝癌治療,從而降低死亡率和醫(yī)療費用.目前,雖然以索拉非尼為代表的一批分子靶向藥物的面世改善了肝癌高死亡率的嚴峻形勢[2],但隨著患者對藥物耐受力的降低及耐藥問題的出現(xiàn),迫切需要療效更好、副作用小的新藥出現(xiàn).總之,發(fā)現(xiàn)藥物干預(yù)新靶點,一直以來都是一個極為重要的臨床關(guān)切.

真核起始因子3 (eukaryotic initiation factor 3,eIF3)是一個800 kDa的分子,是真核起始因子家族中最大的調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物,由13個亞基組成,從eIF3a到eIF3m命名,是哺乳動物細胞中最復(fù)雜的翻譯起始因子.通過控制細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成,eIF3發(fā)揮調(diào)節(jié)細胞生長、增殖等重要功能.在eIF3的13個亞基中,真核起始因子3e亞基(eukaryotic initiation factor 3e subunit,eIF3e)是p48亞基,為細胞內(nèi)mRNA 5’帽子依賴的翻譯起始所必需.有報道eIF3e失調(diào)雖然不直接引發(fā)癌癥,但卻與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[3].在體內(nèi),eIF3e與eIF4G相互作用,且這種相互作用依賴于eIF3e的正常表達; 一旦eIF3e異常表達,會改變eIF3e-eIF4G互作,進一步損傷細胞內(nèi)解旋的mRNA募集43S翻譯前啟動復(fù)合物,從而刺激mRNA的翻譯模式從5’帽子依賴的方式向5’帽子不依賴的方式轉(zhuǎn)換,最終使蛋白質(zhì)合成和細胞生長發(fā)生紊亂[3].然而,eIF3e在惡性腫瘤中的作用在不同類型的腫瘤中的報道相互矛盾.在乳腺癌和肺癌中,eIF3e作為腫瘤抑制因子其表達水平降低,推測下調(diào)后的eIF3e通過TGF-β信號通路導(dǎo)致上皮細胞向間充質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)[4,5].相反,在膠質(zhì)母細胞瘤和結(jié)腸癌以及食道癌中,eIF3e被證明過度表達,其通過缺氧誘導(dǎo)因子促進腫瘤進展,且持續(xù)高表達的eIF3e與不良預(yù)后相關(guān)[6-8].迄今為止,eIF3e在HCC中的作用尚未公布.

因此,為了驗證eIF3e是否與HCC發(fā)生發(fā)展相關(guān),我們先通過手術(shù)切除的肝臟組織水平驗證,再運用細胞模型改變eIF3e的表達水平,對細胞的增殖、遷移、凋亡等行為以及動物中致瘤的影響進行系統(tǒng)地調(diào)查.所取得的結(jié)果顯示,eIF3e與肝癌發(fā)生和發(fā)展密切正相關(guān),可能是HCC干預(yù)新靶點,該工作對于癌癥的治療或診斷及預(yù)后具有潛在的臨床意義.

1 材料和方法

1.1 材料 組織標(biāo)本來源： 5例HCC病人施肝移植手術(shù)后的新鮮肝癌組織及癌旁組織標(biāo)本由武漢大學(xué)中南醫(yī)院肝膽疾病研究院提供,并經(jīng)過當(dāng)事人簽署知情同意書.癌旁組織預(yù)先通過免疫組化分析檢測,顯示為不含腫瘤細胞的正常肝組織.

1.2 方法

1.2.1 過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒的構(gòu)建： 載體pcDNA3.1經(jīng)Xho Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切后,與預(yù)先PCR擴增的目的基因eIF3e (NM_001568.3)連接,構(gòu)建成重組質(zhì)粒pcDNA3.1-eIF3e,用于eIF3e在細胞中的過表達.

設(shè)計一對干擾eIF3e的序列,以及一對無關(guān)序列作為干擾的陰性對照,見表1.所設(shè)計的一對寡核苷酸鏈,每條均為60 nt,5’端和3’端分別含Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ酶切位點,便于與pSuper載體連接.5’端19 nt的編碼序列與靶基因同源,是干擾正義序列; 另一段19 nt的序列與其反向互補,是干擾反向序列,正義序列和反向序列在表1中以加粗標(biāo)示,其間有9 nt的TTCAAGAGA間隔序列形成環(huán)狀結(jié)構(gòu),末端加有轉(zhuǎn)錄終止信號TTTTT.具有上述結(jié)構(gòu)特征的二條互補的寡核苷酸鏈經(jīng)退火、磷酸化后形成雙鏈DNA,然后定向插入預(yù)先經(jīng)Bgl Ⅱ和Hind Ⅲ雙酶切的含H1啟動子的pSuper載體中,構(gòu)建成pSupersheIF3e,該質(zhì)粒在細胞內(nèi)經(jīng)轉(zhuǎn)錄后形成RNA自身發(fā)卡環(huán),經(jīng)Dicer酶切為siRNA發(fā)揮干擾作用.無關(guān)干擾序列構(gòu)建的質(zhì)粒為pSuper-Sn (pSuper-scramble),作為干擾的陰性對照組.

1.2.2 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染： 正常肝細胞系HL7702和二種肝癌細胞系HepG2及Huh7購自美國模式培養(yǎng)物集存庫,并在含10%胎牛血清(Gibco,美國)的DMEM培養(yǎng)液(Gibco,美國)中生長,37 ℃,5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

用Lipofectamine 2000 (Invitrogen,美國)試劑盒將質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染導(dǎo)入細胞.轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-eIF3e 24 h、48 h、72 h后檢測細胞內(nèi)eIF3e蛋白表達的上調(diào)情況,轉(zhuǎn)染pSuper-sheIF3e 24 h、48 h、72 h后檢測細胞內(nèi)其表達水平的下調(diào)情況.

為了獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染eIF3e的HepG2即eIF3e-HepG2,用含G418培養(yǎng)液篩選陽性細胞克隆子.按以上瞬時轉(zhuǎn)染方法,先將含neo標(biāo)記的pcDNA3.1-eIF3e加入培養(yǎng)24 h以上75%匯合度的HepG2中后,以500 μg/mL G418篩選2 wk,待對照組細胞全部死亡后,將G418濃度降至200 μg/mL維持篩選.挑選陽性克隆子擴大培養(yǎng),抽提細胞RNA進行qRT-PCR,鑒定eIF3e的表達情況.該穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞克隆子用于后續(xù)的裸鼠成瘤實驗.

表1 引物序列表

1.2.3 RNA提取和qRT-PCR分析： RNA的提?。?根據(jù)供應(yīng)商(Invitrogen,美國)提供的方法,使用Trizol試劑從病人手術(shù)切除的新鮮組織或細胞中提取總RNA.qRT-PCR分析： 使用Primescript RT試劑盒(Takara,日本)制備cDNA,進行PCR擴增.根據(jù)LightCycler?96實時PCR系統(tǒng)(Roche,瑞士)的標(biāo)準(zhǔn)協(xié)議,使用SYBR premix ex TAQ Ⅱ (Takara,日本)進行實時定量分析.以β-actin作為內(nèi)部參比,將2-△△CT值歸一化為β-actin.eIF3e的引物序列和β-actin的引物序列見表1,所有引物均由武漢Quintarabio公司化學(xué)合成.

1.2.4 Western Blot： 細胞裂解獲取總蛋白質(zhì),采用分離膠為10%,濃縮膠為5%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳.用半干轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移至聚二氟乙烯膜上,使用1：300倍稀釋的山羊抗兔eIF3e一抗(Abcam,英國) 4 ℃過夜孵育,隨后用1：3000倍稀釋的山羊抗兔IgG (H+L)二抗繼續(xù)室溫孵育1 h,最后用ECL免疫印跡試劑盒(Biorad,美國)成像曝光,用條帶密度分析軟件Image J對信號進行半定量分析.

1.2.5 細胞增殖、遷移和凋亡： 細胞增殖采用CCK-8法檢測瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h、48 h、72 h后在450 nm的OD值; 細胞遷移在轉(zhuǎn)染質(zhì)粒0 h、24 h、48 h、72 h后,采用劃痕試驗法,用軟件自動測量劃痕區(qū)域細胞遷移的距離,計算遷移率.劃痕距離測量為等效測量,劃痕寬度平均值=劃痕空隙面積/長度.細胞遷移率=(0 h劃痕寬度-N h培養(yǎng)后劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%,N在本實驗中分別代表24 h、48 h、72 h; 細胞凋亡選用Annexin V-FITC/PI雙染細胞凋亡檢測試劑盒 (凱基生物,產(chǎn)品編號KGA106,中國江蘇),使用流式細胞儀(BD Accuri C6,BD Biosciences,美國)進行凋亡檢測.

1.2.6 裸鼠皮下成瘤實驗： BALB-c/c裸小鼠購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物實驗方案預(yù)先經(jīng)湖北工業(yè)大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn).以eIF3e-HepG2為實驗組,普通HepG2為對照組,皮下成瘤實驗評價eIF3e對裸鼠腫瘤生長的影響.將5周齡、體重18-20 g的雄性BALB/c裸鼠按以上二種不同細胞分為二個處理組,每組14只小鼠,每只動物腹股溝部位接種0.1 mL 1×106-5×106處于對數(shù)生長期80%-90%匯合度的細胞.從第6天起從每組隨機挑取3只小鼠,頸椎離斷處死,分別測量和比較新生腫瘤的重量和體積; 每間隔6 d取一次樣,至第24天結(jié)束,共計4次.24 d內(nèi),每組均有2只小鼠在不同時間死亡,統(tǒng)計數(shù)據(jù)時將其排除,每組實際統(tǒng)計12只小鼠數(shù)據(jù),共24只.

統(tǒng)計學(xué)處理采用Prism 7圖形軟件(GraphPad軟件公司,美國)整理實驗數(shù)據(jù),使用SPSS 19.0 (IBM,美國)進行統(tǒng)計分析,所有結(jié)果均為三次獨立實驗的平均值,結(jié)果為mean±SD,所有組之間的比較采用未配對學(xué)生t檢驗或單因素方差分析,P＜0.05差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01差異顯著.

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織及肝癌細胞系中均發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性eIF3e表達上調(diào) 表2總結(jié)了5例施行肝移植手術(shù)的HCC病人的基本臨床特征.用qRT-PCR檢測肝癌組織和癌旁組織內(nèi)eIF3e的mRNA水平,以及正常肝細胞系HL7702和二種肝癌細胞系HepG2及Huh7內(nèi)eIF3e的mRNA水平,見圖1A和圖1B.從圖1A結(jié)果看,5例病人肝癌組織內(nèi)elF3e的mRNA量均高于癌旁組織內(nèi)elF3e的mRNA量,最低者高出約30% (第3例病人),最高者是癌旁組織的3.1倍(第4例病人).5例肝癌組織中elF3e的mRNA量比癌旁組織內(nèi)elF3e的mRNA量平均高出約2倍(第1例至第5例病人肝癌組織內(nèi)elF3e的相對mRNA量(2.3+1.5+1.3+3.1+1.7)/5=1.98).圖1B結(jié)果與圖1A組織中的結(jié)果一致,二種肝癌細胞系HepG2及Huh7內(nèi)elF3e的mRNA量均高于正常肝細胞系HL7702內(nèi)elF3e的mRNA量,其中HepG2最高.HepG2中elF3e的mRNA量約為HL7702中elF3e mRNA量的1.8倍,Huh7中其mRNA量約為HL7702中的1.2倍.由于HepG2中eIF3e內(nèi)源性表達水平稍高,在隨后的實驗中,我們以HepG2作為細胞模型進一步開展調(diào)查.

表2 5例施行肝移植手術(shù)的原發(fā)性肝細胞癌病人的基本臨床特征

圖1 肝癌組織和癌旁組織以及肝癌細胞系和正常肝細胞系中內(nèi)源性eIF3e mRNA相對轉(zhuǎn)錄率及其表達水平的比較.A:qRT-PCR分析和比較5例病人新鮮肝癌組織(左)及癌旁組織(右)內(nèi)elF3e mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平.將每個病人自身的肝癌組織和癌旁組織分為一組,每組中癌旁組織內(nèi)mRNA定量數(shù)據(jù)設(shè)置為1; B:qRT-PCR分析和比較正常肝細胞系HL7702和二種肝癌細胞系HepG2及Huh7內(nèi)源性elF3e mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平.將HL7702的mRNA定量數(shù)據(jù)設(shè)置為1.A和B的結(jié)果均以β-actin作為內(nèi)部參比進行了校正,結(jié)果是三次獨立實驗的平均值(aP＜0.05,bP＜0.01); C:Western Blot分析和比較5例HCC組織(T)及癌旁組織(N)內(nèi)eIF3e蛋白表達水平.N和T后面的數(shù)字相同則表示同一位病人,N與T之間的短線表示總是以相同病人的N和T二者的數(shù)據(jù)進行比較.N和T下面所列數(shù)字為對應(yīng)Western Blot條帶強度的量化值,分別以β-actin作為內(nèi)部參比進行了校正.

圖2 qRT-PCR分析和比較瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-eIF3e不同時間后HepG2以及穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞eIF3e-HepG2內(nèi)eIF3e mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平.加入等量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑但未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2為對照組,其mRNA定量數(shù)據(jù)設(shè)置為1; 轉(zhuǎn)染空載體pSuper的處理組為零對照組.以上結(jié)果以β-actin作為內(nèi)部參比進行了校正,結(jié)果是3次獨立實驗的平均值(bP＜0.01).

圖3 qRT-PCR分析和比較瞬時轉(zhuǎn)染pSuper-sheIF3e不同時間后HepG2細胞內(nèi)eIF3e mRNA相對轉(zhuǎn)錄水平.加入等量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑但未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2為空白對照組(Mock),其mRNA定量數(shù)據(jù)設(shè)置為1; 轉(zhuǎn)染空載體pSuper的處理組為零對照組; Sn為無關(guān)干擾的陰性對照組.以上結(jié)果以β-actin作為內(nèi)部參比進行了校正,結(jié)果是三次獨立實驗的平均值(bP＜0.01).

對上述5例HCC病人手術(shù)后的HCC組織及癌旁組織同樣開展Western Blot分析,比較HCC組織和癌旁組織eIF3e蛋白表達水平的差異,結(jié)果見圖1C.觀察到此5例病人HCC組織T中的eIF3e表達量均高于癌旁組織N中相應(yīng)表達量.其中第1例病人和第4例病人最為明顯,HCC組織中該蛋白表達量比癌旁組織中分別高出25倍(T1：N1=435：17)及138倍(T4：N4=138：0); 第2例病人二者差異為1.1 (T2：N2=127：112),第3例差異為1.5 (T3：N3=145：97),第5例1.3 (T5：N5=214：168).

2.2 eIF3e表達水平與HepG2增殖和遷移正相關(guān) 用qRTPCR及Western Blot定量檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細胞內(nèi)elF3e轉(zhuǎn)錄水平和表達水平的變化.瞬時/穩(wěn)定轉(zhuǎn)染含eIF3e的過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-eIF3e或能特異性沉默eIF3e的干擾質(zhì)粒pSuper-sheIF3e進入HepG2,驗證細胞內(nèi)eIF3e表達水平是否改變.

實驗結(jié)果如圖2所示.瞬時轉(zhuǎn)染24 h、48 h、72 h后,或?qū)τ诜€(wěn)定轉(zhuǎn)染eIF3e的細胞eIF3e-HepG2,用qRTPCR檢測各組細胞內(nèi)eIF3e mRNA的轉(zhuǎn)錄水平.從圖2中可以看出,在轉(zhuǎn)染24 h后,含eIF3e質(zhì)粒的過表達組該基因mRNA相對表達量為空白對照組的5倍; 轉(zhuǎn)染48 h后eIF3e過表達組上調(diào)了7.5倍; 72 h后eIF3e過表達組上調(diào)超過10倍; 穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞eIF3e-HepG2內(nèi)eIF3e mRNA的轉(zhuǎn)錄水平略低于10倍,結(jié)果高于瞬時轉(zhuǎn)染48 h的但略低于72 h的.該結(jié)果說明,無論瞬時轉(zhuǎn)染或是穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-eIF3e后,細胞內(nèi)eIF3e轉(zhuǎn)錄水平均明顯上調(diào),而且瞬時轉(zhuǎn)染72 h后eIF3e的mRNA量與對照組差別達到最大,轉(zhuǎn)錄水平上升最多.

從圖3可以看出,轉(zhuǎn)染24 h后,eIF3e干擾組mRNA水平略低于細胞空白對照組; 轉(zhuǎn)染48 h后,eIF3e干擾組mRNA水平與細胞空白對照組相比下降了一半; 轉(zhuǎn)染72 h后,eIF3e干擾組mRNA與對照組相比僅剩余0.3,下降了70%,同時,空載體pSuper組和無關(guān)干擾Sn組mRNA表達量和細胞空白對照組相比在這三個時間段變化不大.綜合實驗結(jié)果,說明干擾質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后,沉默eIF3e效果是明顯的,且隨著時間的推移下調(diào)程度越來越大,至72 h抑制程度最大.

由于72 h后的檢測結(jié)果最好,接下來用Western Blot檢測不同質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染72 h后HepG2細胞內(nèi)的eIF3e蛋白表達水平,結(jié)果見圖4.以加入等量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑但未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2為空白對照組,將其Western Blot結(jié)果設(shè)置為100,發(fā)現(xiàn)pcDNA3.1及pSuper二組空載體組、以及Sn無關(guān)干擾組與空白對照組中的eIF3e條帶相當(dāng)(102：103：98：100); pcDNA3.1-eIF3e過表達組中eIF3e條帶是空白對照組中相應(yīng)條帶的3倍(298：100),而sh eIF3e干擾組中該條帶僅是空白對照組中相應(yīng)條帶的68%,下降了32%.以上結(jié)果證明對eIF3e的過表達和干擾均成功.

分別用pcDNA3.1-eIF3e或pcDNA3.1-sheIF3e瞬時轉(zhuǎn)染肝癌細胞系HepG2,以空載體pcDNA或pSuper以及無關(guān)干擾載體pSuper-Sn作對照,用CCK-8法檢測HepG2中eIF3e表達的變化對細胞增殖的影響.實驗結(jié)果見圖5.實驗設(shè)置分組,分別在轉(zhuǎn)染24 h、48 h和72 h后檢測HepG2的增殖情況,結(jié)果用OD450nm值表示.圖5A為轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-eIF3e質(zhì)粒和空載質(zhì)粒pcDNA3.1后24 h至72 h的HepG2增殖情況.從圖中可以看出,eIF3e過表達組相較于空載體對照組,在第48 h和72 h,對HepG2增殖有一定的促進作用.圖5B為轉(zhuǎn)染pSuper-sheIF3e干擾質(zhì)粒,pSuper空載體和Sn質(zhì)粒后24 h至72 h的HepG2增殖情況,從中可以看出,干擾eIF3e的表達組相比較于空載體組和無關(guān)干擾對照組,48 h和72 h后,對HepG2細胞的增殖有一定的抑制作用.因此可以得出結(jié)論,在HepG2細胞中,過表達eIF3e可以促進HepG2細胞增殖,干擾eIF3e的表達則起到抑制增殖的相反作用.

分別用pcDNA3.1-eIF3e或pSuper-sheIF3e瞬時轉(zhuǎn)染HepG2,以空載體pcDNA或pSuper為零對照,以無關(guān)干擾載體pSuper-Sn作陰性對照,用劃痕法檢測在HepG2中eIF3e表達的變化對細胞遷移的影響.實驗結(jié)果如圖6,7.圖6為瞬時轉(zhuǎn)染eIF3e過表達質(zhì)粒pcDNA3.1-eIF3e與空載質(zhì)粒pcDNA3.1后進行細胞劃痕實驗,分別在0 h、24 h、48 h和72 h用倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞的遷移情況,從圖6A細胞原始遷移圖以及圖6B細胞遷移率統(tǒng)計結(jié)果圖中,均觀察到從24 h起過表達eIF3e促進HepG2細胞遷移,且這種差距在48 h和72 h一直維持.eIF3e組：pcDNA3.1對照組遷移率分別為： 24 h后8.1%：5.4%,48 h后14.3%：8.7%,72 h后22.3%：11.8%.圖7為轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒pSuper、干擾質(zhì)粒pSuper-sheIF3e,以及無關(guān)干擾質(zhì)粒Sn的結(jié)果.同樣在0 h、24 h、48 h和72 h后用倒置顯微鏡下觀察并拍照記錄細胞的遷移情況.從圖7A細胞原始遷移圖以及圖7B細胞遷移率統(tǒng)計結(jié)果圖中,均觀察到從24 h起干擾質(zhì)粒sheIF3e組細胞遷移率與空載體組和無關(guān)干擾組相比較變慢,且這種差距自48 h和72 h變得明顯.sheIF3e組：Sn組：pSuper組遷移率分別為： 24 h后9.4%：11.0%：11.3%,48 h后13.7%：18.7%：15.6%,72 h后17.3%：22.4%：21.3%.結(jié)果說明干擾eIF3e的表達能抑制HepG2細胞的遷移.

綜合以上實驗結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)： eIF3e表達水平與HepG2增殖和遷移正相關(guān),上調(diào)eIF3e促進HepG2增殖和遷移,下調(diào)eIF3e則抑制其增殖和遷移.

圖4 Western Blot分析瞬時轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒72 h后HepG2細胞內(nèi)eIF3e蛋白的表達水平.對照組:加入等量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑但未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2為空白對照組; 空載體pcDNA3.1和pSuper:零對照組; eIF3e:過表達組; sheIF3e:干擾組; Sn:無關(guān)干擾組.所列數(shù)字為對應(yīng)條帶強度的量化值,將空白對照組設(shè)置為100,分別以β-actin作為內(nèi)部參比進行了校正.

圖5 CCK-8法分析eIF3e表達的變化對細胞增殖的影響.A:過表達質(zhì)粒eIF3e瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,eIF3e表達的變化對細胞增殖的影響; B:干擾質(zhì)粒sheIF3e瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞后,eIF3e表達的變化對細胞增殖的影響.空載體pcDNA3.1(A)或pSuper(B):對照組; Sn:無關(guān)干擾組.圖中顯示瞬時轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h、48 h、72 h后的各組細胞OD450nm吸收值的變化趨勢,每個處理組設(shè)置3個重復(fù)樣品,結(jié)果是三次獨立實驗的平均值(bP＜0.01).

圖6 劃痕法分析過表達質(zhì)粒eIF3e瞬時轉(zhuǎn)染HepG2不同時間后,eIF3e表達上調(diào)對細胞遷移的影響.A:pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染的對照組(左)與eIF3e過表達轉(zhuǎn)染組(右)的細胞原始遷移圖; B:是將A的原始遷移數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞遷移率后的比較圖.每個處理組設(shè)置3個重復(fù)樣品,結(jié)果是三次獨立實驗的平均值(aP＜0.05,bP＜0.01).

2.3 敲低eIF3e表達水平后促進HepG2凋亡 實驗設(shè)置為過表達組(圖8A)和干擾敲低組(圖8B)共二個組.對于A組,以加入等量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑但未轉(zhuǎn)染任何質(zhì)粒的HepG2為空白對照組,以轉(zhuǎn)染空載體pcDNA的為零對照組.對于B組,以pSuper作零對照組,Sn干擾的陰性對照組.用流式分選法檢測不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染72 h后HepG2中eIF3e表達的變化對細胞凋亡的影響.用Annexin V-FITC/PI染色細胞48 h后觀察凋亡結(jié)果,二組結(jié)果見圖8A和8B.

從圖8A中發(fā)現(xiàn),eIF3e過表達組的細胞凋亡情況,與不加質(zhì)粒的HepG2及空載體pcDNA3.1二個對照組相比較,基本沒有差別.右上角Q1-UR第二象限方框中代表雙染色陽性死細胞比例,eIF3e：HepG2：pcDNA3.1三組分別為1.4%：1.0%：2.8%,數(shù)據(jù)差別無統(tǒng)計學(xué)意義,說明上調(diào)eIF3e表達水平后對HepG2細胞凋亡沒有影響.

與此相對照,圖8B卻顯示,sheIF3e實驗組與pSuper和Sn二個對照組相比較,細胞凋亡明顯增多： 觀察右上角Q1-UR方框內(nèi)死細胞比例,pSuper組1.8%,Sn組2.3%,sh eIF3e組上升至13.2%,是二種對照組的6-7倍,數(shù)據(jù)差別有統(tǒng)計學(xué)意義,說明下調(diào)eIF3e表達水平后促進HepG2細胞凋亡.

2.4 動物實驗證實eIF3e促進腫瘤生長 運用裸鼠皮下成瘤實驗評價eIF3e對腫瘤生長的影響,二組動物分別接種HepG2 (對照組)和eIF3e-HepG2 (實驗組).

圖7 劃痕法分析干擾質(zhì)粒sheIF3e轉(zhuǎn)染HepG2不同時間后,eIF3e表達下調(diào)對細胞遷移的影響.A:pSuper空載體組(左)、eIF3e干擾組(中)及無關(guān)干擾組(右)的細胞原始遷移圖; B:將A的原始遷移數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換為細胞遷移率后的比較圖.每個處理組設(shè)置3個重復(fù)樣品,結(jié)果是三次獨立實驗的平均值(aP＜0.05).

圖8 Annexin V-FITC/PI法評價eIF3e表達水平的變化對HepG2細胞凋亡的影響.A:eIF3e過表達組中eIF3e表達水平的變化對HepG2細胞凋亡的影響; B:eIF3e干擾組中eIF3e表達水平的變化對HepG2細胞凋亡的影響.橫坐標(biāo)代表FITC染色細胞數(shù),縱坐標(biāo)代表PI染色細胞數(shù).每個處理組設(shè)置3個重復(fù)樣品,以上結(jié)果是三次獨立實驗的代表性數(shù)據(jù).

圖9結(jié)果顯示,從第6天起,eIF3e-HepG2組的平均腫瘤體積和重量就大于對照組,且這種差距隨后進一步拉大,第24天eIF3e-HepG2組平均腫瘤達到2000 mm3和2300 mg,而對照組平均值僅為700 mm3和770 mg,二者相差近3倍,顯示eIF3e過表達后促進腫瘤生長.

3 討論

圖9 裸鼠皮下成瘤實驗結(jié)果.A:5周齡、體重18-20 g的雄性BALB/c裸小鼠分為二組,分別皮下接種HepG2及eIF3e-HepG2二組細胞,每只小鼠接種1×106-5×106細胞,從第6天起,每隔6 d從每組中隨機頸椎離斷處死3只小鼠摘瘤,24 d后匯集4次摘除的腫瘤,按組別分類,取代表性樣本按時間順序由左至右擺放,下置游標(biāo)卡尺直觀地顯示腫瘤體積大小; B,C:接種細胞第6、12、18、24天后測量腫瘤的重量和體積,繪制腫瘤生長趨勢圖.每次結(jié)果是同組3個腫瘤數(shù)據(jù)的平均值(bP＜0.01).

HCC是最常見的癌癥類型,在與癌癥相關(guān)的死亡率中,HCC排名第二位[10-13],2012年全球估計有746000例死亡[14].據(jù)估計,每年HCC發(fā)病率在60萬至80萬之間,占所有人類癌癥的5.6%,預(yù)計到2030年將達到約一百萬例[15].在發(fā)展中國家,HCC的地域差異很大,超過80%的HCC發(fā)生在亞洲和撒哈拉以南非洲[16].盡管如此,在美國和其他發(fā)達國家,HCC的發(fā)病率仍在上升[10].與HCC相關(guān)的危險因素包括慢性HBV和HCV感染、酒精性肝病和非酒精性脂肪肝[16].據(jù)2015年中國各類腫瘤發(fā)病率和死亡率統(tǒng)計,我國肝癌的年死亡率為466.1/100000人,在惡性腫瘤死亡順位中占第3位,在城市中僅次于肺癌,農(nóng)村中僅次于胃癌和食管癌[17].早期肝癌的治療選擇包括： 手術(shù)切除,射頻/微波消融,經(jīng)動脈化學(xué)栓塞,肝移植以及化療[14].然而,治愈性治療的主要挑戰(zhàn)是肝癌的復(fù)發(fā),導(dǎo)致其在5年內(nèi)的發(fā)生率超過70%[13],并且無法獲得適當(dāng)匹配的供體進行肝移植[14].此外,在無法切除的復(fù)發(fā)性基礎(chǔ)肝功能不全患者中,全身化療無效,生存率低[13].由于目前臨床上越來越多的患者對以索拉非尼為代表的一批常見藥物的耐受力降低并出現(xiàn)耐藥問題,迫切需要探索治療干預(yù)新靶點從而發(fā)現(xiàn)新藥,該工作具有重要的科學(xué)意義和臨床價值.

eIF3e是eIF3復(fù)合物的組分,為調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成的翻譯起始所必需,它在蛋白質(zhì)合成機制和翻譯控制中的改變可導(dǎo)致特異性mRNA的選擇性翻譯,其促進腫瘤細胞存活、血管生成、轉(zhuǎn)化、侵襲和轉(zhuǎn)移[18].翻譯起始因子在功能上也與癌基因相互作用,并且通常是構(gòu)成大多數(shù)人類癌癥的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要目標(biāo)[18].因此,翻譯控制在癌癥發(fā)展的復(fù)雜機制中起著關(guān)鍵作用.

近年陸續(xù)有報道eIF3e在不同類型的惡性腫瘤中發(fā)揮作用,但其究竟是致癌基因還是抑癌因子仍有爭議[4-8].迄今為止,eIF3e在HCC中的作用尚不清楚.本論文通過組織水平、細胞模型和動物實驗首次系統(tǒng)地調(diào)查了eIF3e在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用,發(fā)現(xiàn)該基因的表達與HepG2增殖、遷移等行為正相關(guān).值得注意的是,我們發(fā)現(xiàn)下調(diào)eIF3e表達后促進凋亡,但上調(diào)其表達后視乎對HepG2凋亡無影響.這種情況在真實的體內(nèi)是可能存在的,既某種原癌基因的表達對細胞凋亡的影響并不是雙向調(diào)節(jié)的.HCC的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因、轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的相互作用及調(diào)控.從單個基因的角度來看,某個基因的表達量的改變只能對肝癌發(fā)生發(fā)展的局部作出解釋,而無法從整體行為進行因果關(guān)系的推理,必須看到疾病進展過程中多種基因協(xié)調(diào)作用而產(chǎn)生的高度復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控.另外,由于本研究僅運用了Annexin V法評價細胞凋亡行為,方法學(xué)上顯得比較單一,尚不能確切地定論eIF3e過表達后不影響細胞凋亡,如今后結(jié)合TUNEL法、Caspase-3活性檢測法或熒光顯微鏡觀察細胞核中DNA形態(tài)是否形成凋亡小體,則可以對該基因是否影響細胞凋亡行為作一客觀評價.同時,畢竟要看到本研究采用的HepG2是一個過分簡化的體外細胞模型,其與人體內(nèi)HCC在病理生理學(xué)方面仍存在較大差距,這也是本工作的局限性.通過小鼠或土撥鼠等動物模型進一步研究eIF3e在HCC中的作用,并揭示相關(guān)機理,代表了未來研究的方向.

腫瘤細胞的增殖受多種信號通路影響,目前我們的研究還無法確定eIF3e引起的細胞增殖、遷移、凋亡等行為的改變與信號通路的詳細關(guān)系.eIF3復(fù)合物在腫瘤上的功能已被廣泛研究,其中eIF3e亞基是影響癌癥發(fā)生和發(fā)展的重要因素[19].Desnoyers等[4]人進一步證明,肺和乳腺上皮細胞中eIF3e表達水平降低后能激活TGF-β信號通路而導(dǎo)致EMT.以斑馬魚為模式生物,通過遺傳學(xué)和化學(xué)遺傳學(xué)方法,eIF3e被確定為MEK-ERK信號通路的組織特異性調(diào)節(jié)劑[20].用siRNA沉默eIF3e表達后,細胞中MEK蛋白水平降低.MEK是一種雙重特異性激酶,位于Ras和Raf的下游,通過關(guān)鍵的酪氨酸和蘇氨酸殘基的磷酸化進一步激活ERK1/2[21].MEK-ERK途徑的異常調(diào)節(jié)可導(dǎo)致不受控制的細胞生長并導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化[22],靶向MEK-ERK途徑的小分子是治療癌癥的潛在方法[23,24].在今后研究中,我們將著重研究在動物模型和人體組織內(nèi),eIF3e通過哪些信號通路推動HCC發(fā)生和發(fā)展,這對于了解HCC致病機理,尋找HCC治療干預(yù)新靶點,均具有十分積極的意義.

文章亮點

實驗背景

原發(fā)性肝細胞癌(primary hepatocellular carcinoma,HCC)惡性程度高,浸潤和轉(zhuǎn)移性強,發(fā)病時癥狀隱匿.在多數(shù)情況下,HCC在中晚期才被診斷出來,預(yù)后較差,現(xiàn)有治療手段效果欠佳.因此,急切需要尋找藥物干預(yù)新靶點.真核起始因子3e亞基(eukaryotic initiation factor 3e subunit,eIF3e)是eIF3的13個亞基中的一個,為細胞內(nèi)mRNA 5’帽子依賴的翻譯起始所必需.有報道eIF3e表達失調(diào)與癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān),但在不同類型的惡性腫瘤中eIF3e所發(fā)揮的作用相互矛盾.迄今eIF3e在HCC中的作用尚不清楚.

實驗動機

本工作首次運用組織標(biāo)本、肝癌細胞系模型以及裸鼠實驗,系統(tǒng)地調(diào)查eIF3e在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用.

實驗?zāi)繕?biāo)

先通過手術(shù)切除的肝癌組織水平驗證,再運用HepG2細胞模型改變eIF3e的表達水平,對細胞的增殖、遷移、凋亡等行為進行系統(tǒng)評估.最后,開展裸鼠致瘤實驗觀察eIF3e對腫瘤生長的影響.

實驗方法

隨機采集5例實施肝移植手術(shù)的HCC病人的新鮮肝癌組織及癌旁組織,用qRT-PCR和Western Blot分析和比較組織內(nèi)eIF3e的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平.瞬時轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-eIF3e或pSuper-eIF3e進入HepG2,用qRT-PCR及Western Blot分別驗證細胞內(nèi)eIF3e mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達水平的變化,證實其過表達上調(diào)和干擾后的下調(diào).分別采用Kit-8細胞計數(shù)法、劃痕法和Annexin V-FITC/PI雙染細胞流式分析評價eIF3e表達水平的變化對HepG2增殖、遷移、凋亡的影響; 運用裸鼠成瘤實驗評價eIF3e對腫瘤生長的影響.

實驗結(jié)果

發(fā)現(xiàn)肝癌組織及肝癌細胞系HepG2和Huh7中eIF3e表達水平均明顯上升.過表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒分別瞬時轉(zhuǎn)染HepG2后,發(fā)現(xiàn)eIF3e表達升高后增強HepG2增殖和遷移,但不影響凋亡; 而eIF3e表達降低后抑制HepG2增殖和遷移,促進凋亡.體內(nèi)某種原癌基因的表達對細胞凋亡的影響可能并不是雙向調(diào)節(jié)的,HCC的發(fā)生和發(fā)展涉及多種基因、轉(zhuǎn)錄本和蛋白質(zhì)的相互作用及調(diào)控,單個基因的表達量改變只能對肝癌發(fā)生和發(fā)展的局部作出解釋,而無法從整體行為進行因果關(guān)系的推理,必須看到疾病進展過程中多種基因協(xié)調(diào)作用而產(chǎn)生高度復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控.另外,本研究僅運用了Annexin V-FITC/PI法評價細胞凋亡,方法學(xué)上顯得比較單一,尚不能確切地定論eIF3e過表達后不影響細胞凋亡.最后,裸鼠實驗證實,和HepG2對照組比較,持續(xù)表達eIF3e的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系eIF3e-HepG2促進腫瘤生長.

實驗結(jié)論

本研究初步發(fā)現(xiàn)過表達eIF3e與HCC的發(fā)生和發(fā)展正相關(guān),這將對HCC診斷、預(yù)后及尋找藥物治療的新靶點提供線索.

展望前景

本研究僅采集5例HCC病人肝癌組織標(biāo)本分析,樣本量有限; 另外,采用的HepG2畢竟是一個過分簡化的體外細胞模型,其與人體內(nèi)HCC在病理生理學(xué)方面仍存在差距.未來需要通過大規(guī)模HCC組織標(biāo)本分析及動物實驗,進一步驗證eIF3e在HCC發(fā)生和發(fā)展中的作用,并揭示相關(guān)分子機理,以探究該基因是否能提示診斷和預(yù)后,或作為藥物干預(yù)的新靶點.