陳 懿,李 雪,陳金霞,林文雅,張友才

陳懿,李雪,陳金霞,林文雅,張友才,溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院感染內(nèi)科 浙江省溫州市 325000

0 引言

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)惡性程度高,發(fā)展迅速,且易于復(fù)發(fā).手術(shù)難以切除或失去根治機會,對化療藥物不敏感,經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞術(shù)等可能會加重癌腫組織缺血、缺氧,改變腫瘤細胞內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄活性,啟動應(yīng)激反應(yīng),誘導(dǎo)腫瘤細胞逃逸凋亡,是嚴重危害人類生命健康的重大疾病之一.

PI3K/AKT/mTOR信號通路在細胞適應(yīng)生理條件和環(huán)境壓力過程中,發(fā)揮極其重要的負向調(diào)節(jié)作用,是自噬啟動階段的關(guān)鍵分子之一,同時參與腫瘤細胞遷移、黏附、細胞基質(zhì)的降解[1,2].白花丹醌是天然的植物化學(xué)物質(zhì),具有抗菌、抗氧化、抗肝損傷以及逆轉(zhuǎn)肝纖維化的作用[3-5].有報道稱白花丹醌可能通過PI3K/AKT信號傳導(dǎo)途徑,影響腫瘤細胞自噬活性,具有抗腫瘤作用[6,7].但其對肝細胞癌的發(fā)生和進展的影響目前仍未見報道.本研究擬借助黃曲霉毒素B1 (aflatoxin B1,AFB1)誘導(dǎo)型大鼠HCC模型,研究中藥白花丹醌對大鼠早期HCC細胞自噬活性的影響,并探討其抗肝細胞癌機制是否與PI3K/AKT信號通路相關(guān).

1 材料和方法

1.1 材料 4周齡清潔級近交系雄性Wistar大鼠,體重60-80 g,由中國科學(xué)院上海實驗動物中心提供.AFB1為美國Sigma公司產(chǎn)品(批號A6636),白花丹醌購自美國Sigma公司,二甲基亞砜(DMSO)和2-乙酰氨基芴(2-AAF)購于廣州偉伯化工有限公司(編號226388、304-28-9),2-AFF飼料為將基本飼料粉碎后,按150 g/1000 g比例充分混合而成.總RNA提取(TaKaRa RNAiso Plus)、cDNA合成及RT-PCR擴增試劑盒(TaKaRa RNA PCR Kit 3.0)均為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品.Akt抗體購自上海雷浩信息科技有限公司; 磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)一抗購自武漢博士德生物工程有限公司; 二抗、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)購自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司.兔抗LC3B抗體(北京華夏遠洋科技有限公司,產(chǎn)品編號：AL221).二喹啉甲酸(BCA)購自上海潤成生物科技有限公司.

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立： 55只雄性Wistar大鼠按清潔級動物要求養(yǎng)在溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心,溫度控制在24℃±1 ℃,相對濕度45%-70%.基本飼料安靜飼養(yǎng)1 wk后分成對照組,AFB1誘癌模型組、2 mg/kg白花丹醌處理組和3 mg/kg白花丹醌處理組; 對照組10只,其他每組15只.對照組給予0.9%氯化納溶液 2 mL/Kg腹腔注射,其他組大鼠腹腔注射AFB1 (400 μg/kg,AFB1用15 mL DMSO溶劑混勻),每周6次,持續(xù)2 wk; 2-AFF飼料喂養(yǎng)2 wk后,重復(fù)上述制作過程(13 wk后用基本飼料喂養(yǎng)),于37周時停藥[8].白花丹醌處理組大鼠在應(yīng)用AFB1基礎(chǔ)上,于第6周起腹腔注射白花丹醌,每周2次.于實驗第37周斷頸處死所有大鼠.模型制作過程中任大鼠自由飲水、進食.

1.2.2 透射電鏡組織超微病理觀察： 將所取新鮮肝組織切成1 mm3大小,用2.5%戊二醛固定,PBS 漂洗后,1%鋨酸固定,制成2 μm超薄切片,用醋酸雙氧鈾、枸椽酸鉛雙重染色,HITACHI日本H-7500型透射電鏡觀察.

1.2.3 AKT1mRNA表達(RT-PCR)： 用RNAiso Plus試劑提取總R N A,紫外分光光度計測吸光度(A)值,以A260/A280=1.8-2.0為RNA質(zhì)量判斷標準.按試劑盒說明書要求合成cDNA.AKT1上游引物： 5’-CCACAGGTCGCTACTATGCC-3’,下游引物： 5’-GTCCAGGGCGGACACAATCT-3’; GAPDH上游引物5’-TTCAACGGCACAGTCAAGG-3’,下游引物5’-CACCAGTGGATGCAGGGAT-3’; 產(chǎn)物長度分別為275 bp、477 bp.反應(yīng)條件： 94 ℃預(yù)變性5 min后,95 ℃ 30 s,52℃ 30 s,72 ℃ 45 s,循環(huán)30次后,72 ℃延伸5 min.取PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL,用2%瓊脂糖凝膠電泳分離后,在凝膠成像系統(tǒng)(Biosens Sc 810)分析結(jié)果.

1.2.4 AKT1免疫組織化學(xué)染色： 按過氧化物酶標記鏈霉親和素法試劑盒說明書操作.60 ℃烤片1 h,二甲苯、乙醇脫蠟至水,3%過氧化氫溶液 37 ℃溫育阻斷內(nèi)源性過氧化物酶,0.01%枸櫞酸緩沖液高壓修復(fù),自然冷卻后滴加AKT1一抗(1：50稀釋),4 ℃溫育過夜; 滴加二抗及鏈霉親和素-過氧化物酶,DAB顯色,蘇木精復(fù)染,脫水、封片.用PBS代替一抗作陰性對照.

1.2.5 Western Blot檢測肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白： 自噬形成時,胞漿型LC3(即LC3-I)會酶解掉一小段多肽,轉(zhuǎn)變?yōu)?自噬體)膜型(即LC3-II),因此,LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低.取-80 ℃保存的肝組織,各組大鼠肝組織均取0.1 g,冰浴,加500 μL組織裂解液和5 μL 磷酸酶抑制劑,冰浴勻漿,4 ℃,以13800íg離心10 min,收集上清液置-80 ℃冰箱保存.使用前用BCA蛋白濃度檢測法檢測蛋白水平,蛋白稀釋至50 ng/μL 后取15 μL上樣,進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)膜至二氟化樹脂膜,5%脫脂奶粉封閉,一抗封閉4 ℃過夜,二抗(羊抗兔) 37 ℃溫育1 h,增強化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白表達,Gel-Pro 3.1軟件測定各條帶的灰度值,經(jīng)內(nèi)參照GAPDH校正后得到蛋白相對表達量.

統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)處理,計量數(shù)據(jù)用mean±SD表示,各組樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析,Levene法檢驗方差齊性,方差齊時采用LSD-t檢驗,方差不齊時采用Dunnett T3檢驗,P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝組織超微病理改變 實驗大鼠中,對照組大鼠無死亡,AFB1誘癌模型組7只大鼠死亡,死亡率為46.67% (7/15),2 mg/kg白花丹醌處理組5只大鼠死亡,死亡率為33.33% (5/15),3 mg/kg白花丹醌處理組3只大鼠死亡,死亡率為 20.00% (3/15).對照組大鼠肝組織質(zhì)地柔軟,表面光滑,邊緣整齊,肝小葉結(jié)構(gòu)正常,肝細胞索排列規(guī)則有序,未見炎性反應(yīng)、變性和壞死.模型組和處理組大鼠,肝表面可見微小顆粒,或大小不一結(jié)節(jié),或腫塊,肝細胞核異型性明顯,病理檢查證實有肝癌發(fā)生.

電鏡下肝細胞腫脹明顯,核體積增大,核膜固縮,異染色質(zhì)在核膜下聚集,核仁深染(圖1A).細胞漿內(nèi)線粒體數(shù)目增多、腫脹,嵴變短、減少,基質(zhì)密度增加,呈粗顆粒狀.粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生,呈囊性擴張或成泡狀.部分肝細胞內(nèi)可見線管狀滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)增生.糖原顆?？梢?瘤細胞大小不一致,胞核深染、大小不均.核膜曲折內(nèi)陷或外凸,異染色質(zhì)豐富,呈粗顆粒狀彌漫分布或凝集成塊堆集在核膜下.可見巨核、雙核,甚至多核,胞核形態(tài)不規(guī)整,可見怪異核,核仁體積增大,數(shù)目增多,形態(tài)不規(guī)則,靠邊(圖1B).

圖1 大鼠肝組織超微病理.A:腫瘤組織; B腫瘤組織; C:自噬細胞; D:自噬細胞.

3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝癌組織中多見細胞自噬現(xiàn)象(8例),AFB1誘癌模型2例,2 mg/kg白花丹醌處理組4例.電鏡下細胞內(nèi)大塊致密物沉積,核固縮、濃集,細胞器少見(圖1B),新月狀或杯狀,雙層或多層膜,有包繞胞漿成分的趨勢(圖1C).雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu),內(nèi)含胞漿成分,如線粒體(圖1D).

2.2 肝組織中AKT1表達 AKT1 mRNA表達(RT-PCR)結(jié)果(圖2),AFB1誘癌模型組與對照組比較,大鼠肝組織中AKT1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為17.013、9.986,均P＜0.001); 2 mg/kg白花丹醌處理組與AFB1誘癌模型組,大鼠肝組織中AKT1 mRNA表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=-2.378,P=0.030),蛋白表達水平稍有減少,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-1.811,P=0.089); 3 mg/kg白花丹醌處理組與AFB1誘癌模型組,大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t值分別為-17.980、-4.247,均P＜0.001)(見表1).免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示(圖3),AKT1陽性為細胞核染成棕黃色,陰性為細胞核淡藍色.對照組大鼠肝組織AKT1蛋白在匯管周圍少量表達,肝細胞內(nèi)幾乎無表達; AFB1誘癌模型組大鼠肝組織AKT1蛋白在匯管區(qū)和部分肝細胞核表達,表達量較對照組明顯增加,經(jīng)白花丹醌處理后,肝組織AKT1蛋白表達量稍有減少,而3 mg/kg白花丹醌處理組表達顯著減少.

2.3 肝組織中LC3B-Ⅰ、LC3B-Ⅱ蛋白表達 Western印跡檢測肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白結(jié)果(圖4),與對照組比較,AFB1誘癌模型組大鼠肝組織中LC3B-II/I比值稍有上升,差異無顯著性(t=2.053,P=0.057).與AFB1誘癌模型組比較,2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝組織中LC3B-II/I比值均明顯升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.420,P=0.028;t=35.136,P＜0.001),大鼠肝組織中LC3B-II/I比值在2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌處理組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=21.316,P＜0.001)(表2).

2014年12月，國務(wù)院批準了財政部制定的改革方案，確立了政府會計改革的指導(dǎo)思想、基本原則、主要任務(wù)、具體內(nèi)容、配套措施、實施步驟和組織保障。明確提出了此次改革任務(wù)：建立健全政府會計核算體系、報告體系。為以后建成我國特色的政府會計準則體系奠定堅實基礎(chǔ)。

2.4 肝組織中AKT1 mRNA表達與LC3B-II/I比值的相關(guān)性 在3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝細胞癌組織中,其AKT1 mRNA表達與LC3B-II/I比值間存顯著負相關(guān)(r=-0.611,P=0.035),見圖5.

3 討論

PI3K/AKT/mTOR信號通路在細胞適應(yīng)生理條件和環(huán)境壓力過程中,發(fā)揮極其重要的負向調(diào)節(jié)作用,是自噬啟動階段的關(guān)鍵分子,參與腫瘤細胞遷移、黏附、細胞基質(zhì)的降解[9].活化的AKT可直接磷酸化mTOR的Ser2448位點,激活下游分子mTOR,后者引起自噬蛋白Atg13過磷酸化,使Atg13與Atg1相互作用的親和力降低,調(diào)控與細胞自噬發(fā)生相關(guān)的多種效應(yīng)分子的磷酸化,調(diào)控自噬蛋白的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)位過程.mTOR激酶活性受抑制時,Atg13部分脫磷酸化,誘導(dǎo)自噬的發(fā)生[10].自噬是細胞質(zhì)蛋白和細胞器降解的主要途徑,與腫瘤抑制相關(guān),特別是在肝臟[11].

表1 AFB1誘導(dǎo)肝細胞癌模型大鼠肝組織中AKT1 mRNA、蛋白表達(mean±SD)

表2 AFB1誘導(dǎo)肝細胞癌模型大鼠肝組織中LC3-II/I比值的變化(mean±SD)

圖2 RT-PCR法測AKT mRNA表達.1:分子量marker; 2:3 mg/kg白花丹醌處理組; 3:對照組; 4:AFB1誘癌模型組; 5:2 mg/kg白花丹醌處理組.

白花丹醌,為一種具有潛在的抗癌活性的萘醌化合物.有研究報道,白花丹醌的提純物可能通過ERK和PI3K抑制劑,快速誘導(dǎo)自噬活性,顯著抑制祼鼠MDAMB-231乳腺癌細胞的生長,具有強有力的廣譜抗腫瘤活性[6].Ma等[12]報道,白花丹醌通過活化細胞自噬途徑和線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑,顯著抑制AGS胃癌細胞增殖、抑制細胞浸潤和遷移.Lin等[13]報道,白花丹醌以劑量和時間依賴方式,抑制人肝癌SMMC-7721細胞株的細胞增殖,SMMC-7721 細胞內(nèi)有自噬體形成和LC3 蛋白表達,有效抑制祼鼠移植瘤的生長,誘導(dǎo)細胞凋亡、自噬.我們的實驗電鏡結(jié)果顯示,白花丹醌處理組大鼠肝癌組織中多見細胞自噬現(xiàn)象.與AFB1誘癌模型組比較,2 mg/kg白花丹醌和3 mg/kg白花丹醌處理組大鼠肝組織中LC3B-II/I比值均明顯升高,以3 mg/kg白花丹醌處理組更顯著.結(jié)合電鏡結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn),白花丹醌可顯著增加AFB1誘導(dǎo)型大鼠肝癌細胞自噬活性.

圖3 各組實驗大鼠肝組織AKT 1免疫組織化學(xué)染色(DAB顯色).A:對照組; B:AFB1誘癌模型組; C:2 mg/kg白花丹醌處理組; D:3 mg/kg白花丹醌處理組(A、B放大100倍,C、D放大200倍).DAB:二氨基聯(lián)苯胺.

圖4 Western blot法測肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白表達.1:對照組; 2:3 mg/kg白花丹醌處理組; 3:2 mg/kg白花丹醌處理組; 4:AFB1誘癌模型組.

圖5 3 mg/kg白花丹醌處理組肝細胞癌組織中AKT1 mRNA表達與LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值間相關(guān)性分析.

白花丹醌具有抗腫瘤作用,但其抗癌機制尚未闡明.Xue等[14]報道,白花丹醌可能通過抑制AKT/mTOR信號通路,增加細胞內(nèi)活性氧物質(zhì)的含量,提高順鉑對CAL27細胞、順鉑耐受的CAL27/CDDP細胞的細胞毒性、凋亡和自噬作用,抑制舌鱗狀細胞癌發(fā)生和進展.我們的實驗結(jié)果顯示,AFB1誘癌模型組大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達水平均明顯增加,應(yīng)用3 mg/kg白花丹醌預(yù)處理后,大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達明顯下降.這些證據(jù)表明,白花丹醌能有效抑制AFB1誘導(dǎo)性大鼠肝細胞癌組織中AKT1表達,這證實了白花丹醌可能通過抑制AKT/mTOR信號通路,發(fā)揮抗肝臟腫瘤作用.

有部分研究報道了自噬與腫瘤進展的關(guān)系,但HCC腫瘤組織中AKT表達與自噬活性之間相關(guān)性的研究,目前少有報道.我們的研究結(jié)果顯示,AFB1誘導(dǎo)型大鼠肝細胞癌組織中,AKT1 mRNA表達與LC3B-II/I比值存在顯著負相關(guān)(P=0.035).我們推測HCC組織中自噬活性的增加,可能抑制AKT的表達.

綜上所述,我們發(fā)現(xiàn)AFB1誘導(dǎo)HCC模型大鼠肝組織中,AKT1表達明顯升高,應(yīng)用白花丹醌可顯著抑制AKT1表達,使肝腫瘤組織中自噬活性增加,且AKT1表達與自噬活性之間存在顯著負相關(guān).因此,我們推測白花丹醌可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制AFB1誘導(dǎo)型大鼠肝細胞癌組織中AKT1的表達,增加肝癌細胞自噬活性,從而發(fā)揮抗肝臟腫瘤的作用.然而,白花丹醌藥理活性廣泛,對組織氧環(huán)境、細胞內(nèi)氧壓力的改變,也有可能改變細胞自噬活性,除PI3K/AKT/mTOR信號通路外,且存在多種影響細胞自噬活性的信號傳導(dǎo)途徑.因此,白花丹醌抗腫瘤的機制有待進一步研究.

實驗背景

自噬在調(diào)節(jié)肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的進展中起重要作用.白花丹醌具有抗腫瘤作用,但抗癌機制未明確.本研究采用白花丹醌干預(yù)黃曲霉毒素B1 (aflatoxin B1,AFB1)誘導(dǎo)型大鼠HCC細胞,探究其對HCC自噬活性影響及潛在機制.

實驗動機

白花丹醌是天然的植物化學(xué)物質(zhì),探究其對HCC自噬活性的影響及潛在機制,對藥物的臨床應(yīng)用具有積極意義.

實驗?zāi)繕?/p>

探究白花丹醌對大鼠HCC自噬活性影響,并初步探究其潛在機制.

實驗方法

制作大鼠HCC模型并用白花丹醌干預(yù),透射電鏡觀察肝組織和自噬細胞的超微結(jié)構(gòu).RT-PCR和免疫組織化學(xué)染色技術(shù)測AKT1 mRNA和蛋白的表達.Western Blot測肝組織中LC3BⅠ、LC3BⅡ蛋白表達.比較各組間AKT1 mRNA和蛋白表達差異,及LC3B-Ⅱ/Ⅰ比值差異.

實驗結(jié)果

白花丹醌可顯著增加AFB1誘導(dǎo)型大鼠HCC細胞自噬活性.AFB1誘癌模型組大鼠肝組織中AKT1 mRNA 和蛋白表達水平均明顯增加,應(yīng)用3 mg/kg白花丹醌預(yù)處理后,大鼠肝組織中AKT1 mRNA和蛋白表達明顯下降.

實驗結(jié)論

白花丹醌可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR信號通路,抑制AFB1誘導(dǎo)型大鼠HCC組織中AKT1的表達,增加HCC細胞自噬活性,從而發(fā)揮抗HCC的作用.

展望前景

白花丹醌可以增加HCC自噬活性,抑制早期HCC進展,為藥物的臨床應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ).