劉建軍，黃世鋒，代文婷，翟丹丹，宗 凱

(1.合肥市第二人民醫(yī)院藥學(xué)部，安徽 合肥 230011； 2.中華人民共和國(guó)合肥海關(guān)技術(shù)中心，安徽 合肥 230022)

黃芪藥用始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為“補(bǔ)藥之長(zhǎng)”，至今已有2 000多年的藥用歷史[1]。明代李時(shí)珍在《本草綱目》中記載，黃芪能補(bǔ)諸虛不足，助氣壯筋骨，止腹痛泄痢[2]?！吨腥A人民共和國(guó)藥典：一部》(2015年版)收錄了蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao和膜莢黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. 的干燥根為藥用[3]。研究結(jié)果表明，不同基源、產(chǎn)地及生長(zhǎng)年限的黃芪藥材，其化學(xué)成分存在顯著的差異[4]。從黃芪中分離得到多種化學(xué)活性成分，對(duì)機(jī)體心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等的效果顯著，具有良好的抗腫瘤、抗疲勞和抗衰老作用[5]。

黃芪屬是一個(gè)多態(tài)性類群，種類繁多，變異較大，全世界有11個(gè)亞屬2 500多種，主要分布于北半球的溫帶地區(qū)和南美洲，中亞和西亞也有廣泛分布[6]。雖然蒙古黃芪和膜莢黃芪在植物形態(tài)上存在一定差異，但兩者的藥材或飲片難以區(qū)別，僅依賴形態(tài)學(xué)、組織學(xué)和化學(xué)成分分析等方法來(lái)鑒定存在主觀性較大、特異性不強(qiáng)以及對(duì)觀察者經(jīng)驗(yàn)要求高等缺陷，不利于規(guī)范化、標(biāo)準(zhǔn)化方法的建立及普及[7]。為了更好地利用中藥資源，近年來(lái)分子鑒定方法開(kāi)始應(yīng)用于中藥鑒定。DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)具有快速、微量和特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，該技術(shù)的研究和應(yīng)用為解決藥材的鑒別問(wèn)題提供了客觀而有效的手段[8]。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(internal transcribed spacer，ITS)序列為一段核糖體非編碼序列，具有核苷酸序列上的高度變異性，又具有長(zhǎng)度上的保守性，非常適用于易混淆生藥品種及近緣生藥品種的鑒定[9-10]。已有研究采用該技術(shù)評(píng)價(jià)不同產(chǎn)地的蒙古黃芪ITS序列的變化[11]、黃芪與其偽品的ITS序列分子鑒定[12]以及蒙古黃芪和膜莢黃芪的鑒別[13]。為了尋找新的快速、準(zhǔn)確區(qū)分蒙古黃芪和膜莢黃芪的方法，本研究通過(guò)比對(duì)黃芪ITS全序列篩選出單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)差異位點(diǎn)并設(shè)計(jì)引物，通過(guò)對(duì)兩種黃芪ITS序列差異分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，進(jìn)而為鑒別市售黃芪飲片的基源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器：NanoDrop 2000型核酸蛋白分析儀(Thermo Scientific公司)。

1.1.2 藥材與試劑：(1)藥材。蒙古黃芪植物樣品分別采集自甘肅、河北和內(nèi)蒙古(編號(hào)H-mg-1至H-mg-12號(hào))，蒙古黃芪對(duì)照藥材(120974-201311和120974-201110，編號(hào)S-mg-8和S-mg-9)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；膜莢黃芪植物樣品采集自河北和甘肅(編號(hào)H-mj-9至H-mj-14)，膜莢黃芪對(duì)照藥材(121462-201003和121462-201304，編號(hào)S-mj-11和S-mj-12)購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。所有植物樣品均由河北省邯鄲市藥品檢驗(yàn)所的孔增科教授和亳州市藥監(jiān)局孫全峰副主任中藥師鑒定。1—16號(hào)黃芪飲片均采集自合肥市地區(qū)醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥房，編號(hào)為P-1至P-16。(2)試劑。磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒(珠海寶銳生物公司)；2×Taq DNA Master Mix(TAKARA公司)。

1.2 方法

1.2.1 總DNA提取：采用磁珠法提取總DNA。取黃芪藥材適量，粉碎后取5 mg置于1.5 ml離心管中，按照磁珠法植物基因組DNA提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，使用NanoDrop 2000型蛋白核酸分析儀測(cè)定樣品DNA的光密度，-20 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)與合成：選擇GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已提交的黃芪ITS全序列，如GenBank登錄號(hào)為膜莢黃芪JX017320.1、蒙古黃芪KJ999353.1，設(shè)計(jì)通用引物后對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行擴(kuò)增[12]。蒙古黃芪和膜莢黃芪通用檢測(cè)引物見(jiàn)表1。

表1 蒙古黃芪和膜莢黃芪特異性檢測(cè)引物

1.2.3 DNA擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)分析：(1)ITS通用引物的擴(kuò)增條件為，反應(yīng)體系總體積為20 μl，包括商品化的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)體系2×Taq DNA Master Mix(TAKARA公司)10 μl，上下游引物各1 μl(10 pmol)，模板DNA 2 μl，ddH2O 6 μl。(2)反應(yīng)條件為，預(yù)變性溫度95 ℃，時(shí)間為5 min；變性溫度為95 ℃，時(shí)間為30 s；退火溫度為52 ℃，時(shí)間為30 s；復(fù)性溫度為72 ℃，時(shí)間為30 s；延伸溫度為72 ℃，時(shí)間為7 min；循環(huán)次數(shù)為30次，最后于4 ℃下保存。ITS通用引物擴(kuò)增后進(jìn)行電泳分析，PCR產(chǎn)物送南京金斯瑞公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果采用Clustal X軟件進(jìn)行比對(duì)分析，MEGA 6.0軟件中的鄰位相連(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，采用最大復(fù)合似然法(maximum composite likelihood，MCL)構(gòu)建模型，使用1 000次重復(fù)檢測(cè)的Bootstrap值表示樹(shù)上各節(jié)點(diǎn)的支持率。

1.2.4 市售黃芪飲片的基源分析：利用已知黃芪標(biāo)準(zhǔn)品構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)群體，將市售黃芪飲片樣品ITS基因測(cè)序結(jié)果導(dǎo)入系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分類和鑒定。

2 結(jié)果

2.1 黃芪藥材ITS全序列結(jié)果分析

黃芪ITS全序列(G+C)%含量約65%。序列比對(duì)結(jié)果表明，蒙古黃芪和膜莢黃芪ITS序列同源性極高，22份黃芪樣品在整個(gè)ITS全序列區(qū)域僅存在幾個(gè)堿基突變類型，在第1位堿基上均為A，在第128位堿基上有G/A突變，第619位堿基上有G/-/T/C突變，第620位堿基上有T/C突變，第621位堿基上有C/A突變，第622位堿基上有A/-/C突變，第623位堿基上有C/A/-突變，見(jiàn)表2。

2.2 黃芪的遺傳距離及系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA 6.0軟件將上述22份已知黃芪藥材的序列用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖1。結(jié)果表明，22份樣本聚類后可分為兩大組，第1組為膜莢黃芪，第2組為蒙古黃芪。由圖1可見(jiàn)，通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可以區(qū)分膜莢黃芪和蒙古黃芪的遺傳進(jìn)化關(guān)系，進(jìn)而為其鑒定提供依據(jù)。

表2 14份蒙古黃芪和8份膜莢黃芪樣本ITS全序列SNP位點(diǎn)

注：“-”表示該位點(diǎn)缺失1個(gè)堿基

Note：“-” indicates that one base is missing at this site

圖1 蒙古黃芪和膜莢黃芪基于ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

2.3 黃芪飲片的檢測(cè)和分析結(jié)果

基于以上研究設(shè)計(jì)，本課題組收集了16份市場(chǎng)上銷售的黃芪飲片，通過(guò)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的鑒別蒙古黃芪與膜莢黃芪的引物，結(jié)合已知的黃芪對(duì)照藥材(S-mg-8、S-mg-9、S-mj-11和S-mj-12)進(jìn)行擴(kuò)增后電泳并測(cè)序，采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)其種類進(jìn)行區(qū)分鑒定，結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。從構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)可知，P-4、P-10、P-11和P-16號(hào)黃芪飲片經(jīng)鑒定為膜莢黃芪，其余為蒙古黃芪，表明該方法能夠應(yīng)用于市場(chǎng)上銷售的黃芪飲片基源的鑒定。

表3 黃芪飲片ITS全序列SNP位點(diǎn)

注：“-”表示該位點(diǎn)缺失1個(gè)堿基

Note：“-” indicates that one base is missing at this site

圖2 基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)鑒別黃芪飲片的基源

3 討論

分子鑒定技術(shù)是指通過(guò)直接分析遺傳物質(zhì)DNA的多態(tài)性來(lái)推斷物種內(nèi)在的遺傳變異而實(shí)現(xiàn)藥材鑒定的方法，其中DNA條形碼技術(shù)近年來(lái)得到了廣泛應(yīng)用，該技術(shù)具有不受形態(tài)特征和生物個(gè)體發(fā)育限制，檢測(cè)樣本范圍廣，高效、準(zhǔn)確及易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的特點(diǎn)[14]?；贗TS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)不僅可以分析不同物種親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，而且可以直觀表現(xiàn)不同物種的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。韓奇亨等[15]采集列當(dāng)屬藥用植物進(jìn)行總DNA提取、PCR擴(kuò)增和測(cè)序，將得到的測(cè)序結(jié)果使用MEGA 6.0軟件進(jìn)行分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果表明ITS序列能夠作為列當(dāng)屬植物的分子鑒別方法。劉洋洋等[16]利用ITS序列對(duì)不同來(lái)源的遼細(xì)辛進(jìn)行DNA分子鑒定，從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果可見(jiàn)，ITS序列可以對(duì)細(xì)辛原植物進(jìn)行鑒別，且在近緣物種鑒定方面具有較大應(yīng)用價(jià)值。在鑒定中藥偽品方面，基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)方法近年來(lái)也得到越來(lái)越多的重視。李振華等[17]利用ITS2序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，成功鑒別出6種假龍膽屬植物，表明該技術(shù)可以作為假龍膽屬植物的分子鑒定方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。姚能等[18]建立了基于ITS2序列的多基源藥材鉤藤DNA條形碼鑒定技術(shù)方法，能夠成功用于鉤藤藥材真?zhèn)舞b定，為臨床準(zhǔn)確用藥提供依據(jù)?；贗TS序列構(gòu)建黃芪的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)并用于市售黃芪飲片的基源分析，目前尚未有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，是值得探索的研究?jī)?nèi)容。蒙古黃芪和膜莢黃芪同屬于豆科黃耆屬植物，為同屬間不同種的近緣關(guān)系，其遺傳學(xué)上的進(jìn)化距離不大。本研究采用短序列ITS序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)以鑒定市售黃芪飲片基源，因此，使用了NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，并以Bootstrap作1 000次可信度分析，以增加本研究的可信度。

本研究從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了蒙古黃芪和膜莢黃芪的ITS全序列，包含了RNA ITS1-5.8S和ITS2序列，并根據(jù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)黃芪通用引物，首先對(duì)已明確基源的黃芪藥材提取DNA進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行分析。結(jié)果表明，蒙古黃芪和膜莢黃芪ITS序列同源性極高，22份黃芪樣品在整個(gè)ITS全序列區(qū)域僅存在幾個(gè)堿基突變類型，說(shuō)明僅憑借單個(gè)SNP位點(diǎn)分析不易區(qū)分兩種黃芪的基源，而通過(guò)分析ITS全序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，可以較為準(zhǔn)確地達(dá)到鑒別的目的。鄭司浩等[13]采用三對(duì)特異性引物鑒別蒙古黃芪方法，發(fā)現(xiàn)蒙古黃芪ITS序列第476位點(diǎn)為堿基C，而膜莢黃芪為堿基T。本研究采用一對(duì)通用引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物，蒙古黃芪ITS序列第128位點(diǎn)為堿基G，而膜莢黃芪為堿基A；并且在鑒別黃芪飲片基源的過(guò)程中，隨行加入了兩種黃芪對(duì)照藥材，聚類分析結(jié)果證實(shí)可有效鑒別蒙古黃芪和膜莢黃芪，且市售黃芪飲片中蒙古黃芪占主要部分。

綜上所述，因蒙古黃芪和膜莢黃芪同屬豆科黃耆屬植物，親緣關(guān)系近，基因差別小，以往使用單基因差異很難對(duì)其進(jìn)行鑒別；此外，蒙古黃芪和膜莢黃芪表型形狀差異不突出，存在混雜種植和相互雜交的情況，因此，兩種黃芪之間基因差異越來(lái)越小，區(qū)分的難度加大。這就要求首先構(gòu)建一個(gè)充分體現(xiàn)黃芪屬種內(nèi)變異和種間分化的完整的參考序列數(shù)據(jù)庫(kù)，用以進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析和準(zhǔn)確的物種界定。黃芪樣品在整個(gè)ITS全序列區(qū)域僅存在幾個(gè)堿基突變類型，僅用聚類分析進(jìn)行分析鑒定，結(jié)果可信度有限，這是今后需要進(jìn)一步完善的研究。