靳雅惠

(西安外事學(xué)院，陜西 西安 710077)

桂郁金是姜科植物廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS. G. Lee et C. F. Liang 的干燥塊根，是《中國(guó)藥典》規(guī)定的郁金的來源之一，具有活血止痛，行氣解郁等功效[1]，常用于胸脅刺痛，胸痹心痛等癥的治療。隨著臨床上藥材需求的不斷增加，桂郁金作為郁金的主要來源，產(chǎn)量占比60%[2]。然而，桂郁金種質(zhì)資源豐富，且存在著較大的差異性，種質(zhì)資源沒有一套完善的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。所以，迫切需要從分子水平著手，揭示不同種質(zhì)內(nèi)在的差異性，從基因角度篩選出優(yōu)良種質(zhì)，為桂郁金的臨床用藥等方面提供幫助。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列(simple sequence repeat，SSR)，是一種重復(fù)單元，通過1～6個(gè)核苷酸串聯(lián)重復(fù)序列組成[3]。它以PCR反應(yīng)為基礎(chǔ)，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用到功能基因研究[4]，遺傳多樣性分析[5]，遺傳圖譜構(gòu)建[6]等方面的研究。SSR-PCR體系重復(fù)性高，穩(wěn)定性好，卻極易受到引物，模板，以及2×Taq PCR MasterMix(Tap DNA 聚合酶，dNTPs,緩沖液等)因素的影響。目前，尚未見對(duì)桂郁金SSR-PCR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化的報(bào)道，因此，筆者研究可以為桂郁金遺傳多樣性等相關(guān)研究提供參考。

1 材料

實(shí)驗(yàn)所用不同種質(zhì)的桂郁金材料均采自邕寧桂郁金種植基地，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)王建教授鑒定均為桂郁金，即廣西莪術(shù)CurcumakwangsiensisS. G. Lee et C. F. Liang 的干燥塊根。PCR使用的Mix PCR MIX(包括Tap DNA 聚合酶，dNTPs,緩沖液等)是2x濃縮的PCR擴(kuò)增預(yù)混合溶液，從博瑞克公司購(gòu)入。要進(jìn)行PCR，只用在體系中加入模板及引物，不但去掉了復(fù)雜的操作過程，還大大節(jié)約了時(shí)間。實(shí)驗(yàn)所使用的引物為國(guó)外已經(jīng)公布的姜黃屬通用引物。序列為5’→3’(AACGAAGTCGGTGGCGGGAGGTCAAGAACGGTAGG)。通過上海生工合成。

2 方法

2.1 DNA提取

取桂郁金嫩葉0.5～1.0 g，采用楊妮[7]等改良CTAB法進(jìn)行DNA提取，紫外分光光度計(jì)被用以檢測(cè)DNA的質(zhì)量及濃度。

2.2 SSR-PCR反應(yīng)體系的正交設(shè)計(jì)

運(yùn)用L9(33)正交設(shè)計(jì)，對(duì)DNA模板，引物以及2×Taq PCR MasterMix的含量進(jìn)行考察。如表1所示。每次試驗(yàn)均加入適量的ddH2O，使反應(yīng)體系的總量為15μL。

2.3 SSR-PCR反應(yīng)程序的正交設(shè)計(jì)

SSR-PCR反應(yīng)程序采用L16(44)正交設(shè)計(jì)，對(duì)退火時(shí)間、變性時(shí)間、循環(huán)次數(shù)、延伸時(shí)間進(jìn)行考察，以期獲得最佳的反應(yīng)程序。如表2所示。

表1 SSR-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)

表2 SSR-PCR反應(yīng)程序的正交設(shè)計(jì)

2.4 退火溫度的選擇

在上述SSR-PCR反應(yīng)體系建立的基礎(chǔ)上，設(shè)定溫度梯度：54.0℃、54.5℃、55.0℃、55.5℃、56.0℃、56.5℃，篩選出最佳的退火溫度。

2.5 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳

PCR反應(yīng)產(chǎn)物用聚丙烯酰胺凝膠電泳(8%)檢測(cè)，以此來確定最優(yōu)的反應(yīng)體系、反應(yīng)程序、退火溫度以及體系的穩(wěn)定性和適用性等內(nèi)容。

3 結(jié)果分析

3.1 DNA質(zhì)量與濃度檢測(cè)

采用紫外分光光度計(jì)對(duì)提取得到的桂郁金DNA的質(zhì)量和濃度進(jìn)行檢測(cè)，OD260/OD280值為1.8～2.0，濃度50μg·mL-1，此結(jié)果表明，該DNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

3.2 SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

對(duì)實(shí)驗(yàn)建立的9個(gè)不同組合進(jìn)行分析與優(yōu)化，由于模板，引物以及MIX含量的不同，結(jié)果差異明顯。如圖1所示。9個(gè)組合均能擴(kuò)增出條帶，5,7,8,9反應(yīng)體系擴(kuò)增得到的條帶弱，特異性差，2,3,4,6反應(yīng)體系擴(kuò)增得到的條帶較清晰，其中反應(yīng)體系4條帶多，特異性最好。即在15μL體系中，DNA模板2.5μL,引物1.0μmol·L-1,2×Taq PCR MasterMix為6μL，其中Tap DNA聚合酶0.05 U·μL-1，Mg2+3.0 mmol·L-1，dNTPs0.3 mmol·L-1，加ddH2O至15μL。

圖1 桂郁金SSR-PCR反應(yīng)體系 L9(33)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)擴(kuò)增效果

3.3 SSR-PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化

對(duì)實(shí)驗(yàn)所建立的16組SSR-PCR反應(yīng)程序的不同組合進(jìn)行分析與優(yōu)化，結(jié)果如圖2所示。組合條件的不同導(dǎo)致了擴(kuò)增條帶的差異。表現(xiàn)為條帶的顏色深淺不同，效果存在著較大區(qū)別。組合2,13,14條帶較淺，穩(wěn)定性也較差，反應(yīng)體系不理想，綜合實(shí)驗(yàn)結(jié)果，反應(yīng)程序10條帶清晰，穩(wěn)定性較好，因此將反應(yīng)程序10(變性30 s,退火30 s，延伸45 s，循環(huán)35次)作為最優(yōu)方案。

圖2 桂郁金SSR-PCR反應(yīng)程序L16(44)正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)擴(kuò)增效果

3.4 退火溫度的確定

退火溫度的確定是利用以上確定的最佳反應(yīng)體系及反應(yīng)程序進(jìn)行的，本梯度試驗(yàn)的范圍是54.0～56.5℃。結(jié)果如圖3所示。當(dāng)溫度低于54.5℃時(shí)，主帶不清晰，且有許多較淺的雜帶，當(dāng)溫度超過55.5℃時(shí)，條帶的穩(wěn)定性以及多態(tài)性下降。在退火溫度為55℃時(shí)，條帶的清晰度，穩(wěn)定性等均較好，由此確定55.0℃為最佳的退火溫度。

1-2: 54.0℃、3-4:54.5℃、5-6:55.0℃、7-8:55.5℃、

3.5 優(yōu)化體系的驗(yàn)證

采用10份不同種質(zhì)的桂郁金材料對(duì)優(yōu)化得到的體系進(jìn)行驗(yàn)證。擴(kuò)增結(jié)果如圖4所示，10份桂郁金材料均可以擴(kuò)增出清晰、多態(tài)性高、重復(fù)性好的條帶，由此也證明了該優(yōu)化體系的合理性和適用性。

圖4 10份桂郁金材料擴(kuò)增效果

4 討論

桂郁金遺傳多樣性分析以及種質(zhì)篩選等研究是以SSR-PCR反應(yīng)體系，反應(yīng)程序，退火溫度的建立與優(yōu)化為前提和基礎(chǔ)進(jìn)行的。由于不同植物類別并沒有一套通用的SSR-PCR反應(yīng)體系，因此建立適合桂郁金的SSR-PCR反應(yīng)體系是十分必要的。該體系受到了多方面的影響，包括DNA濃度，引物濃度以及2×Taq PCR MasterMix含量的相互作用。筆者實(shí)驗(yàn)與傳統(tǒng)的SSR-PCR反應(yīng)體系建立與優(yōu)化略有不同，傳統(tǒng)的SSR-PCR反應(yīng)體系是采用單因素考察的方法，對(duì)體系內(nèi)各種組分進(jìn)行含量的確定，雖然結(jié)果直觀，卻忽略了系統(tǒng)的整體性，即各組分之間的相互影響與內(nèi)在聯(lián)系。筆者實(shí)驗(yàn)采用正交優(yōu)化的方法，正好彌補(bǔ)了單因素考察的缺陷，充分權(quán)衡了組分內(nèi)在的關(guān)聯(lián)，而且縮短了實(shí)驗(yàn)周期，省時(shí)省力。傳統(tǒng)的SSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化，通常是考察5種因素對(duì)該體系的影響，包括(DNA模板，引物，Tap DNA聚合酶，Mg2+，dNTP)，筆者實(shí)驗(yàn)采用了2×Taq PCR MasterMix，將原本復(fù)雜的5因素變成了3因素，使反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化化繁為簡(jiǎn)，為后續(xù)的實(shí)驗(yàn)提供了便利。筆者實(shí)驗(yàn)建立了可用性高，穩(wěn)定性好的桂郁金SSR-PCR反應(yīng)體系，通過10份桂郁金材料得到驗(yàn)證。

在PCR反應(yīng)中，適合的退火溫度是確保引物以及目的序列可以順利退火的關(guān)鍵因素。如果退火溫度過低，就會(huì)增加非特異性結(jié)合的機(jī)率，從而使雜帶數(shù)量增加；如果退火溫度過高，那么就可能導(dǎo)致不能完全退火或者無(wú)法退火，從而導(dǎo)致無(wú)法擴(kuò)增。為了加快實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，筆者實(shí)驗(yàn)采用的引物是國(guó)外已經(jīng)公布的姜黃屬通用引物，而引物堿基的組成，長(zhǎng)度等因素恰恰影響著退火的時(shí)間和溫度。在后續(xù)試驗(yàn)中，應(yīng)該涉及到桂郁金引物開發(fā)的相關(guān)內(nèi)容，在該體系的基礎(chǔ)上繼續(xù)優(yōu)化，設(shè)計(jì)并篩選出多態(tài)性好，重復(fù)性高的引物，使桂郁金的SSR-PCR反應(yīng)體系更加完善，適合于分析桂郁金的遺傳多樣性以及篩選優(yōu)良種質(zhì)資源等研究。