侯賽紅　孫樹芹　徐萬群　馮文靜　毛擁軍　邢昂

[摘要] 目的 初步探究黃芪多糖（APS）通過自噬途徑對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病心肌病（DCM）大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。

方法 將30只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、DCM組、APS治療組（APS組）。DCM組和APS組大鼠一次性腹腔注射10 g/L的STZ 50 mg/kg建立糖尿病模型，NC組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液;APS組大鼠按1 g·kg-1·d-1灌胃APS，其余兩組大鼠灌胃等體積生理鹽水。干預(yù)16周后，采用經(jīng)胸超聲心動圖評估大鼠的心功能，蘇木精-伊紅染色觀察心肌組織病理學(xué)改變，TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡情況，Western blot檢測心肌組織內(nèi)自噬相關(guān)蛋白p62、LC3的表達(dá)水平。

結(jié)果 與NC組相比，DCM組大鼠心功能顯著降低（F=5.584～342.701，t=3.125～18.648，P<0.05）;心肌組織病理學(xué)改變明顯，表現(xiàn)為心肌細(xì)胞排列紊亂、細(xì)胞界限不清、肌纖維斷裂等，心肌組織內(nèi)細(xì)胞凋亡增多;LC3蛋白表達(dá)顯著降低，p62蛋白表達(dá)顯著增加（F=11.341、22.155，t=4.439、9.409，P<0.05）。APS干預(yù)16周后，與DCM組相比，APS組大鼠心功能得到有效恢復(fù)（t=2.503～13.416，P<0.05）;心肌結(jié)構(gòu)損傷明顯減輕，心肌細(xì)胞凋亡減少;LC3蛋白表達(dá)顯著增加，p62蛋白表達(dá)顯著減少（t=3.714、9.682，P<0.05）。

結(jié)論 APS可能通過上調(diào)心肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平而抑制STZ誘導(dǎo)的DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡，發(fā)揮心臟保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 黃芪多糖;糖尿病心肌病;自噬;肌細(xì)胞，心臟;細(xì)胞凋亡;大鼠

[中圖分類號] R542.2;R329.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A

[文章編號] 2096-5532（2020）03-0293-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.100

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1446.017.html;2020-05-19 17：02

EFFECT OF ASTRAGALUS POLYSACCHARIDES ON CARDIOMYOCYTE APOPTOSIS IN RATS WITH DIABETIC CARDIO-

MYOPATHY

＼ HOU Saihong， SUN Shuqin， XU Wanqun，? FENG Wenjing， MAO Yongjun， XING Ang

＼ （Department of Geriatric Medicine， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266003， China）

[ABSTRACT]＼ Objective＼ To investigate the effect of Astragalus polysaccharides （APS） on cardiomyocyte apoptosis in rats with streptozotocin （STZ）-induced diabetic cardiomyopathy （DCM） via the autophagy pathway.

＼ Methods＼ A total of 30 specific pathogen-free male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group （NC group）， DCM group， and APS treatment group （APS group）. The rats in the DCM group and the APS group were given a single intraperitoneal injection of 10 g/L STZ （50 mg/kg） to establish a model of diabetes， and those in the NC group were given intraperitoneal injection of an equal vo-

lume of sodium citrate buffer. The rats in the APS group were treated with APS （1 g·kg-1·d-1） by gavage， and those in the other two groups were given an equal volume of normal saline by gavage. After 16 weeks of intervention， transthoracic echocardiography was used to evaluate cardiac function， HE staining was used to observe myocardial histopathological changes， TUNEL staining was used to observe cardiomyocyte apoptosis， and Western blot was used to measure the expression of the autophagy-related proteins p62 and LC3 in the myocardium.

＼ Results＼ Compared with the NC group， the DCM group had a significant reduction in cardiac function （F=5.584-342.701，t=3.125-18.648，P<0.05） with marked myocardial histopathological changes （disordered arrangement of cardiomyocytes， unclear cell boundaries， and myofibril breakage） and a significant increase in cardiomyocyte apoptosis with a significant reduction in the protein expression of LC3 and a significant increase in the protein expression of p62 （F=11.341，22.155;t=4.439，9.409;P<0.05）. After 16 weeks of APS intervention， compared with the DCM group， the APS group had effective recovery of cardiac function （t=2.503-13.416，P<0.05）， marked alleviation of myocardial structural damage， and a significant reduction in cardiomyocyte apoptosis， as well as a significant increase in the protein expression of LC3 and a significant reduction in the protein expression of p62 （t=3.714，9.682;P<0.05）.

＼ Conclusion＼ APS may inhibit cardiomyocyte apoptosis in rats with STZ-induced DCM by upregulating the autophagy level of cardiomyocytes and thus exert a cardioprotective effect.

[KEY WORDS]＼ Astragalan; diabetic cardiomyopathies; autophagy; myocytes， cardiac; apoptosis; rats

糖尿病心肌?。―CM）是由糖尿病引起的心肌特異性病變，是糖尿病病人致殘致死的主要原因[1]。

DCM的病理機(jī)制錯綜復(fù)雜，包括代謝紊亂、慢性低度炎癥、微血管結(jié)構(gòu)及功能障礙、自主神經(jīng)功能紊亂、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙等[2]。研究表明，心肌細(xì)胞凋亡增加在DCM的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用[3]。自噬是指通過溶酶體途徑選擇性降解細(xì)胞組分，繼而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞自身代謝需要及循環(huán)更新胞質(zhì)成分的過程，在某些情況下，自噬激活被認(rèn)為具有心臟保護(hù)作用[4]。有研究表明，通過促進(jìn)自噬可緩解凋亡，防治DCM，提示調(diào)控自噬可能是治療DCM的有效策略[5]。黃芪多糖（APS）是黃芪的主要活性成分之一，不僅具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、雙向調(diào)節(jié)血糖、保護(hù)心肝腎等多種藥理活性，還可改善DCM[6]。我們的前期研究表明，APS通過抑制內(nèi)、外源性凋亡途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，抑制心肌細(xì)胞凋亡，改善DCM大鼠心功能[7]。近年來的研究結(jié)果表明，APS可抑制MAP4K3表達(dá)和mTOR信號的下傳，而上調(diào)自噬，通過恢復(fù)自噬通量可改善心肌細(xì)胞功能[8]。然而，APS是否可通過影響DCM大鼠心肌細(xì)胞自噬進(jìn)而改善心肌細(xì)胞凋亡尚不清楚。因此，本研究用APS進(jìn)行干預(yù)，探討其對DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡和自噬途徑的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級健康雄性SD大鼠30只，7～8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動物繁育有限公司。飼養(yǎng)條件：室溫（25±1）℃，濕度（50±10）%，明暗周期12 h，自由飲水和攝食。所有動物相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作均獲得青島大學(xué)動物福利和倫理管理委員會的批準(zhǔn)。

1.1.2 主要藥物及試劑 APS（上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）;鏈脲佐菌素（STZ，Sigma-Aldrich）;檸檬酸鈉緩沖液（0.1 mol/L，pH值4.5，索萊寶公司）;RIPA裂解液和蘇木精-伊紅染色試劑盒（碧云天公司）;LC3和p62抗體（Cell Signaling Technology，USA）;GAPDH抗體（Abcam，USA）;BCA蛋白濃度測定試劑盒（索萊寶公司）;TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Roche，USA）。

1.1.3 儀器和設(shè)備 羅氏優(yōu)越型血糖儀（ACCU CHEK Advantage，Roche， Germany）;Vevo2100超高分辨率小動物彩色多普勒超聲實(shí)時(shí)影像系統(tǒng)（VisualSonics，Canada）;電泳儀（Bio-Rad，USA）;Image-Pro Plus 6.0圖像分析軟件（Media Cybernetic，USA）;石蠟切片機(jī)（Leica RM2265）;全功能微孔板檢測儀（BIO-TEK，USA）;奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（Olympus BX53，Japan）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組及處理 所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，禁食不禁水12 h后，隨機(jī)分為正常對照組（NC組）、DCM組和APS治療組（APS組），每組10只。DCM組和APS組大鼠一次性腹腔注射10 g/L的STZ溶液50 mg/kg[9]（注射前用0.1 mol/L、pH值4.5的檸檬酸鈉緩沖液在冰上避光配制，現(xiàn)配現(xiàn)用）以誘導(dǎo)1型糖尿病模型，NC組大鼠腹腔注射等體積的檸檬酸鈉緩沖液。分別于注射后第3、7天，禁食12 h后從尾靜脈采血測空腹血糖，空腹血糖≥16.7 mmol/L且伴有“三多一少”癥狀者視為造模成功。同時(shí)，參考既往研究[10]，APS組一次性灌胃給予APS溶液1 g·kg-1·d-1進(jìn)行干預(yù)，而NC組和DCM組灌胃等體積的生理鹽水，連續(xù)干預(yù)16周。

1.2.2 血糖和體質(zhì)量監(jiān)測 動物自飼養(yǎng)開始，于每周末同一時(shí)間稱量并記錄大鼠的體質(zhì)量，在禁食12 h后經(jīng)尾靜脈采血測空腹血糖。

1.2.3 超聲心動圖評估心功能 實(shí)驗(yàn)16周后，采用體積分?jǐn)?shù)0.03異氟烷霧化吸入麻醉大鼠，由同一專業(yè)人員使用小動物超聲成像系統(tǒng)檢測經(jīng)胸二維超聲心動圖，獲得以下心功能指標(biāo)：左心室舒張末期直徑（LVEDD）、左心室收縮末期直徑（LVESD）、左心室舒張末期容積（LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）、縮短分?jǐn)?shù)（FS）和射血分?jǐn)?shù)（EF）。重復(fù)測量6個連續(xù)的心動周期。

1.2.4 心肌組織病理觀察 心功能評估結(jié)束后，腹腔注射水合氯醛3 mL/kg麻醉大鼠，迅速分離出心臟，用大量生理鹽水洗去其內(nèi)殘留血液后，將心臟沿心室中間橫向平分，取部分左心室組織浸泡于40 g/L多聚甲醛中固定24 h以上，4 μm石蠟切片后，行蘇木精-伊紅、TUNEL染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察相關(guān)病理改變。

1.2.5 Western blot檢測心肌組織內(nèi)p62和LC3蛋白表達(dá) 使用RIPA裂解液提取心肌組織總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度[11]。根據(jù)測試結(jié)果，將樣品濃度調(diào)至1 g/L，并加入適量4×SDS上樣緩沖液，95 ℃變性10 min。SDS-PAGE分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上。牛奶封閉膜2 h，以TBST洗膜3次后，加相應(yīng)的一抗室溫下孵育2 h，再洗膜3次，然后加與一抗結(jié)合的二抗室溫下孵育1.5 h。以TBST洗膜3次后，使用ECL顯影劑顯影相關(guān)蛋白條帶，用Image J圖像分析軟件分析灰度值，計(jì)算p62和LC3蛋白的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)測量均重復(fù)3次，采用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料數(shù)據(jù)均以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)評估

除去造模失敗、死亡及狀態(tài)不佳不合格大鼠后，每組有6只大鼠納入實(shí)驗(yàn)研究及數(shù)據(jù)分析。STZ注射后，DCM組和APS組大鼠出現(xiàn)明顯的多飲、多尿、多食等糖尿病癥狀，DCM組大鼠體質(zhì)量較NC組明顯下降，血糖較NC組明顯升高，說明模型建立成功。APS干預(yù)后，與DCM組相比，APS組大鼠體質(zhì)量明顯增加，血糖明顯降低，說明APS可改善糖尿病大鼠的體質(zhì)量和血糖。

2.2 各組大鼠心功能比較

與NC組相比，DCM組大鼠LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV顯著增大，EF、FS顯著下降（F=5.584～342.701，t=3.125～18.648，P<0.05），提示其心功能下降。而APS干預(yù)可顯著減小LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV，并抑制FS的下降（t=2.503～13.416，P<0.05），說明APS干預(yù)可一定程度改善DCM大鼠心功能。見表1。

與NC組相比，F(xiàn)=5.584～342.701，*t=3.125～18.648，P<0.05;與DCM組相比，#t=2.503～13.416，P<0.05。

2.3 各組大鼠心肌組織病理學(xué)改變

NC組大鼠心肌細(xì)胞完整，肌纖維排列有序，無凋亡及炎性細(xì)胞浸潤。DCM組大鼠心肌組織發(fā)生明顯改變，出現(xiàn)心肌細(xì)胞肥大和排列紊亂、肌纖維斷裂、細(xì)胞邊界不清和大小不一。APS組大鼠心肌組織排列較DCM組整齊，心肌細(xì)胞凋亡減少，炎癥較輕，說明APS可顯著改善DCM心肌組織病理改變。

2.4 APS對DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡影響

干預(yù)16周后，TUNEL染色結(jié)果顯示，NC組、DCM組和APS組的細(xì)胞凋亡率分別為（11.48±2.44）%、（55.84±7.84）%和（16.31±4.06）%。與DCM組相比，APS組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率明顯下降（F=23.931，t=9.157，P<0.05），說明APS干預(yù)可抑制DCM大鼠心肌細(xì)胞凋亡。

2.5 APS對DCM大鼠心肌組織自噬相關(guān)蛋白表達(dá)影響

干預(yù)16周后，Western blot檢測結(jié)果顯示，相較于NC組，DCM組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)顯著降低，而p62蛋白表達(dá)顯著升高（F=11.341、22.155，t=4.439、9.409，P<0.05），表明在DCM大鼠中心肌細(xì)胞自噬受到抑制。而與DCM組相比，APS組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=3.714、9.682，P<0.05），說明APS干預(yù)可恢復(fù)DCM大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)自噬水平，從而發(fā)揮保護(hù)作用。見表2。

與NC組相比，F(xiàn)=11.341、22.155，*t=4.439、9.409，P<0.05;與DCM組相比，#t=3.714、9.682，P<0.05。

3 討論

糖尿病引起的心血管并發(fā)癥的發(fā)病率及死亡率在全球逐年上升，并帶來高經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，值得重視[12]。其中，DCM是糖尿病病人發(fā)生心力衰竭的主要原因，然而，DCM的確切病理生理機(jī)制尚不清楚。DCM發(fā)病緩慢隱匿，早期即發(fā)生結(jié)構(gòu)和功能異常，包括左心室肥大、心肌纖維化、舒張功能障礙和細(xì)胞信號傳導(dǎo)異常[13]。本研究結(jié)果顯示，DCM組大鼠LVEDD、LVESD、LVESV、LVEDV增大，EF、FS下降，表明其心功能下降;而蘇木精-伊紅染色提示DCM大鼠心肌結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，TUNEL染色提

示心肌細(xì)胞凋亡增加。我們的前期研究顯示，APS可有效緩解DCM的心肌細(xì)胞凋亡，改善大鼠心功能[7]。本實(shí)驗(yàn)APS組大鼠心臟超聲相關(guān)指標(biāo)的改變進(jìn)一步表明，APS可改善DCM大鼠心功能;蘇木精-伊紅及TUNEL染色表明，APS組大鼠心肌結(jié)構(gòu)及心肌細(xì)胞凋亡得到有效改善。但其具體的分子機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步探討。

自噬是一種具有高度保守性、可選擇性地降解過多或有害胞質(zhì)成分（如受損的線粒體或蛋白多聚體）的過程，對細(xì)胞起保護(hù)作用[14]。有關(guān)研究表明，在DCM中自噬不足，而上調(diào)自噬可阻礙DCM進(jìn)展[15]。AMPK的激活可恢復(fù)心臟自噬，可防止心肌細(xì)胞凋亡，改善心功能[16]。在肝臟中，APS以與二甲雙胍類似的方式抑制促凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和上調(diào)受抑制的自噬，恢復(fù)肝功能[17]。此外，APS預(yù)處理可恢復(fù)因阿霉素抑制的心臟自噬，減輕心臟損傷，改善心功能[8]。LC3參與自噬體形成到成熟的各個階段，是目前研究自噬最常用的標(biāo)志物，主要包括LC3-Ⅰ（胞質(zhì)狀態(tài)）和LC3-Ⅱ（膜結(jié)合狀態(tài)）。當(dāng)自噬發(fā)生時(shí)，LC3-Ⅰ被活化，結(jié)合磷脂酰乙醇胺轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅱ，促進(jìn)自噬體形成及成熟[14]，LC3-Ⅱ的變化水平與自噬程度呈正相關(guān)，可部分反映自噬水平。此外，在選擇性自噬中，p62作為自噬受體被特異性招募至自噬體內(nèi)降解，因此也常被作為檢測自噬水平的指標(biāo)。目前，采用Western blot方法檢測LC3-Ⅱ的變化及輔助性檢測p62水平是評估自噬的主要方法[18]。本文研究通過Western blot檢測表明，DCM組大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)LC3蛋白表達(dá)較NC組顯著降低，伴隨p62蛋白表達(dá)升高，表明DCM組心肌細(xì)胞自噬受到抑制;而APS干預(yù)后，與DCM組相比，APS組大鼠心肌組織內(nèi)LC3蛋白表達(dá)上調(diào)，p62蛋白表達(dá)下降。提示APS可能通過自噬途徑有效減少DCM心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，APS能夠有效恢復(fù)自噬活性，減輕糖尿病所致的心肌細(xì)胞凋亡。

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（本文編輯 馬偉平）

[收稿日期]2019-11-09; [修訂日期]2020-03-26

[基金項(xiàng)目]山東省自然科學(xué)基金博士項(xiàng)目（ZR2017BH067）

[第一作者]侯賽紅（1992-），女，碩士研究生。

[通信作者]邢昂（1963-），女，碩士，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師。

E-mail：xingang2005@sina.com。孫樹芹（1985-），女，博士，主治醫(yī)師。E-mail：13895743298@126.com。