阿依妮薩·阿卜力海提 代先興 李猛 王 阿卜杜薩拉木·如則麥麥提 郝海婷

摘要：以阿拉爾墾區(qū)棉花為試材，采用高通量測(cè)序方法研究棉花根系組織和根際土壤的細(xì)菌群落組成及其生態(tài)功能。結(jié)果顯示，棉花根際土壤細(xì)菌豐富度指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）顯著大于根系組織內(nèi)生細(xì)菌豐富度指數(shù)（Chao1）和多樣性指數(shù)（Shannon）。棉花根際土壤中細(xì)菌的各分類水平（門、綱、目、科、屬）數(shù)量大于棉花根系組織中的數(shù)量。物種注釋結(jié)果表明，根系組織和根際土壤兩個(gè)微環(huán)境優(yōu)勢(shì)菌群明顯不同。棉花根系組織和根際土壤優(yōu)勢(shì)菌群不一樣，對(duì)生物防治菌種篩選有一定的指導(dǎo)作用。

關(guān)鍵詞：阿拉爾墾區(qū);棉花;根系組織;根際土壤;細(xì)菌多樣性;高通量測(cè)序方法

中圖分類號(hào)：S562.? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? ? 文章編號(hào)：2095-3143（2020）03-0020-07

DOI：10.3969/j.issn.2095-3143.2020.03.003

Bacterial Diversity of Cotton Root Tissue and Rhizosphere Soil

in Alar Reclamation Area

Ayinisa·Abolihaiti， Dai Xianxing， Li Meng， Wang Zhe， Abodusalamu·Ruzemaimaiti， Hao Haiting

（College of Plant Science， Tarim University.， Alar，Xinjiang 843300， China）

Abstract：? The composition and ecological function of bacterial community in root tissue and rhizosphere soil were studied by high-throughput sequencing， the cotton in Araer Reclamation area was took as experimental material. The results showed that the bacterial richness index （Chao1） and diversity index （Shannon） of cotton rhizosphere soil were significantly higher than those of endophytic bacterial richness index （Chao1） and diversity index （Shannon）. the number of bacteria classification levels （doors， classes， orders， families， genera） were larger than that in the root tissue of cotton. The results of species annotation showed that the dominant bacterial population of root tissue and rhizosphere soil were significantly different. The dominant bacterial population in cotton root tissue was different from rhizosphere soil， which could guide the selection of biological control bacteria.

Key words： Alar reclamation area; Cotton; Root tissue; Rhizosphere soil; Bacterial diversity; High throughput sequencing method

0? 引言

新疆作為我國最大的棉花生產(chǎn)基地，在棉花種植面積、總產(chǎn)、單產(chǎn)、商品調(diào)撥量連續(xù)25年位居全國第一[1]。自2014年棉花目標(biāo)價(jià)格改革試點(diǎn)工作實(shí)施以來，各棉花生產(chǎn)主體在品質(zhì)意識(shí)方面有所增強(qiáng)。一些部分團(tuán)場(chǎng)、當(dāng)?shù)剀埢◤S嚴(yán)格質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，在收購價(jià)格上建立優(yōu)質(zhì)優(yōu)價(jià)的導(dǎo)向[2]。然而，隨著近5年新疆氣候的改變，尤其是降水增多和寒流提前，棉花“三病”（立枯病、枯萎病和黃萎?。3-4]也隨之加重，但還沒有引起足夠的重視。農(nóng)藥品種落后，防治被動(dòng)是嚴(yán)重影響棉花產(chǎn)量和品質(zhì)的主要問題[5]。

目前，利用傳統(tǒng)的分離技術(shù)只能代表一部分可培養(yǎng)微生物，無法分離到棉花中所有微生物。近年來，Illumina 高通量測(cè)序技術(shù)因通量高、檢測(cè)全面、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)能夠更加真實(shí)地揭示微生物種群結(jié)構(gòu)，為獲取更多種類的微生物資源提供了依據(jù)。但目前國內(nèi)有關(guān)棉花根系內(nèi)生菌與根際土壤微生物的菌群特征卻鮮有報(bào)道，因此，作者采用Illumina Mi Seq高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)棉花根系組織以及根際土壤兩個(gè)微環(huán)境細(xì)菌的16S r RNA基因序列進(jìn)行分析，從而更好地揭示棉花根系組織以及根際土壤細(xì)菌的種類組成及菌群多樣性的分布，為進(jìn)一步開發(fā)植物促進(jìn)生長和病害防治的生防菌資源提供依據(jù)。

1? 材料和方法

1.1? 采樣地概括

研究地點(diǎn)位于新疆阿拉爾市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所棉田，該田土質(zhì)條件好，灌排通暢。該地區(qū)屬于溫帶大陸性氣候，日照充足，氣候干旱少雨，晝夜溫差大，阿拉爾地區(qū)年平均氣溫為10.5℃，年平均最高氣溫為18℃;年平均最低氣溫為3℃。

1.2? 材料與取樣方法

棉花品種采用新陸中37號(hào)，采樣時(shí)間為7月，棉花正處于花蕾期，選取棉田健康植株，采集棉花根系及根際粘上的土壤。迅速將土樣保存于帶有冰袋的保溫箱中，帶回實(shí)驗(yàn)室，凍存于裝有10 kg干冰的泡沫盒中，封口，郵寄給北京諾禾致源生物信息科技有限公司。

1.3? 實(shí)驗(yàn)流程

DNA的提取、試驗(yàn)上機(jī)流程、原始測(cè)序數(shù)據(jù)分析等與郝海婷，等[10]人的方法相同，但稍作了修改，由北京諾禾致源生物信息科技有限公司負(fù)責(zé)。具體步驟如下。

1.3.1? DNA的提取

采用CTAB或SDS方法對(duì)樣本的基因組DNA 進(jìn)行提取，之后利用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量的樣本DNA于離心管中，使用無菌水稀釋樣本至1 ng/μl。以稀釋后的基因組DNA為模板，根據(jù)測(cè)序區(qū)域的選擇，使用帶Barcode的特異引物，即“New England Biolabs”公司的 Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer，和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。

引物對(duì)應(yīng)區(qū)域?yàn)?6 S V4區(qū)引物（515F和806R），鑒定細(xì)菌多樣性為PCR產(chǎn)物的混樣和純化，PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè);根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，對(duì)目的條帶使用qiagen公司提供的膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。

1.3.2? 文庫構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序

使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和Q-PCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000 進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3.3? 原始測(cè)序數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增引物序列從下機(jī)數(shù)據(jù)中拆分出各樣本數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后使用FLASH（V1.2.7，http：//ccb.jhu.edu/software/FLASH/）[11]對(duì)每個(gè)樣本的reads進(jìn)行拼接，得到的拼接序列為原始Tags數(shù)據(jù)（Raw Tags）;拼接得到的Raw Tags，需要經(jīng)過嚴(yán)格的過濾處理[12]得到高質(zhì)量的Tags數(shù)據(jù)（Clean Tags）。

1.3.4? OTU聚類和物種注釋

利用Uparse軟件（Uparse v7.0.1001，http：//www.drive5.com/uparse/）[13]對(duì)所有樣本的全部Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性（Identity）將序列聚類成為OTUs（Operational Taxonomic Units），同時(shí)會(huì)選取OTUs的代表性序列，依據(jù)其算法原則，篩選的是OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。 對(duì)OTUs序列進(jìn)行物種注釋，用Mothur方法與SILVA132（http：//www.arb-silva.de/）[14]的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫[15]進(jìn)行物種注釋分析（設(shè)定閾值為0.8～1.0），獲得分類學(xué)信息并分別在kingdom（界）、phylum（門）、class（綱）、order（目）、family（科）、genus（屬）、species（種）水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成。

1.3.5? 樣本復(fù)雜度分析（Alpha Diversity）

使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Chao1，Shannon指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線。

Chao - the Chao1 estimator （http：//scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.chao1.html#skbio.diversity. alpha.chao1）;

Shannon - the Shannon index （http：//scikit-bio.org/docs/latest/generated/skbio.diversity.alpha.shannon.html#skbio.diversity.alpha.shannon）。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及 Alpha 多樣性統(tǒng)計(jì)

通過對(duì)棉花根系和根際土壤不同取樣點(diǎn)進(jìn)行微生物多樣性測(cè)序分析，結(jié)果顯示，根系組織（a1）和根際土壤（a2）可用于后續(xù)分析的有效序列分別為62345和61280條。利用QIIME軟件對(duì)相似度大于97%進(jìn)行分類單元（OTU）聚類，a1和a2兩個(gè)樣本得到OTUs分別為2116和6247種，測(cè)序覆蓋率大于85%。

對(duì)OTU進(jìn)一步分析可知（表1），棉花根際土壤和根系Chao1指數(shù)分別為3633和1317，相差2.7倍;棉花根際土壤Shannon指數(shù)為9.4，而棉花根系Shannon指數(shù)為5.7，相差1.6倍。相對(duì)棉花根系，棉花根際土壤細(xì)菌群落具有較高的豐富度（Chao1）和多樣性（Shannon），說明兩種樣本的菌群多樣性差異顯著。

2.2? 棉花根系和根際土壤微生物群落組成

應(yīng)用RDP classifier軟件分析棉花根際土壤和根系微生物群落組成顯示：根際土壤中各分類水平數(shù)量分別為：門37種，綱45種，目93種，科170種，屬289種;根系組織中各分類水平數(shù)量分別為：門20種，綱26種，目65種，科110種，屬175種。從數(shù)量上來看，根際土壤樣本各分類水平均大于根系組織各分類水平。

在門水平上，由圖1可以看出，根際土壤中變形菌門、芽單胞菌門是棉花根際土壤主要的優(yōu)勢(shì)菌群，所占比例分別為49.7%、11.5%。放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、藍(lán)細(xì)菌門、綠彎菌門在棉花根際土壤中所占比例均大于1%。

棉花根系組織中放線菌門、變形菌門是主要的優(yōu)勢(shì)菌群，所占比例分別為50.9%、43.7%。擬桿菌門所占比例大于1%，藍(lán)細(xì)菌門的比例接近1%。

在屬水平上，由圖2可知，棉花根系和根際土壤樣本中有144種共有屬。根際土壤中有145種特有屬，根系中有31種特有屬，特有屬種類相差4.6倍。

分析144種共有屬表明，棉花根際土壤中假單胞菌屬、沙雷氏菌屬，未鑒定的酸桿菌（unidentified_Acidobacteria）、鞘氨醇單胞菌屬、芽孢桿菌屬、未鑒定的藍(lán)藻細(xì)菌（unidentified_Cyanobacteria）、葡萄球菌屬、溶桿菌屬是主要優(yōu)勢(shì)菌，所占比例均大于1%。棉花根系組織中腸桿菌屬所占比例大于10%，鏈霉菌屬、假黃單胞菌屬、未鑒定的根瘤菌（unidentified_Rhizobiales）、鞘脂菌屬、未鑒定的根瘤菌（unidentified_Rhizobiaceae）、鞘脂單胞菌屬、類固醇桿菌屬、黃桿菌屬、沃斯菌屬、假氨基桿菌屬為主要菌群，所占比例均大于1%。

在種水平上（圖3），根際土壤中的優(yōu)勢(shì)種是粘質(zhì)沙雷菌、佛雷德里克斯堡假單胞菌，所占比例均大于1%。根系組織的優(yōu)勢(shì)種為Rhizobiales bacterium_GB3、Rhizobium helanshanense和解聚乙二醇鞘氨醇盒菌，所占比例均大于1%。

2.3? 棉花根系組織和根際土壤的細(xì)菌功能預(yù)測(cè)分析

根系組織內(nèi)的細(xì)菌在功能方面主要涉及到化學(xué)異養(yǎng)（chemoheterotrophy）和需氧化學(xué)異養(yǎng)（aerobic chemoheterotrophy）。根據(jù)結(jié)果預(yù)測(cè)，根際土壤細(xì)菌涉及的功能種類顯著多于根系。主要包括反硝化（denitrification）、亞硝酸銨化（nitrite ammonification）、硝酸銨化（nitrate ammonification）、亞硝酸鹽呼吸（nitrite respiration）、硝酸鹽呼吸（nitrate respiration）、硝酸鹽還原（nitrate reduction）、硝化作用（nitrification）。從功能預(yù)測(cè)結(jié)果也反映了根系組織內(nèi)生菌群落和棉花根際土壤環(huán)境中微生物群所扮演的角色不同。

3? 討論

高通量測(cè)序技術(shù)區(qū)別于傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法，能高效、系統(tǒng)地了解微生物的全貌。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)棉花根系組織和根際土壤微生物進(jìn)行測(cè)序和分類，發(fā)現(xiàn)根際土壤微生物群落指數(shù)Chao1和Shannon均高于根系組織內(nèi)生物群落指數(shù)Chao1和Shannon，分別約高2.7倍和1.6倍，說明棉花根系組織微環(huán)境和接觸的根際土壤微環(huán)境存在很大差異。

對(duì)各個(gè)分類水平分析發(fā)現(xiàn)，棉花根際土壤微生物多樣性在門、綱、目、科和屬水平上都大于棉花根系組織內(nèi)生菌的種類。且棉花根系組織和根際土壤兩個(gè)不同的微環(huán)境，優(yōu)勢(shì)菌群顯著不同。在門水平上，棉花根際土壤中優(yōu)勢(shì)菌群主要是變形菌門，而棉花根系組織的優(yōu)勢(shì)菌群主要是變形菌門和放線菌門。棉花根際土壤中大于1%的菌群有7個(gè)，分別為放線菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、厚壁菌門、硝化螺旋菌門、藍(lán)細(xì)菌門和綠彎菌門;而根系組織中只有擬桿菌門，可見棉花根系組織和根際土壤兩個(gè)微環(huán)境下微生物群落顯著不同，說明棉花根系組織和根際土壤兩個(gè)微環(huán)境菌群所行使的功能不同。

對(duì)種水平的進(jìn)一步分析表明，棉花根際土壤中優(yōu)勢(shì)種是粘質(zhì)沙雷氏菌、佛雷德里克斯堡假單胞菌。有研究表明，粘質(zhì)沙雷氏菌具有促進(jìn)植物生長作用[16-17];佛雷德里克斯堡假單胞菌具有將土壤中的不溶性磷源溶解成為可溶性、并能促進(jìn)植物生長等作用[18-19]。這說明這兩種菌對(duì)棉花的生長起到了積極地作用。根系組織的優(yōu)勢(shì)種為R.bacterium_GB3、R.helanshanense和解聚乙二醇鞘氨醇盒菌。R.bacterium_GB3和R.helanshanense都屬于根瘤菌，具有固氮的作用。解聚乙二醇鞘氨醇盒菌為可產(chǎn)鐵載體，可以向寄主植物提供可利用的鐵元素，也可與環(huán)境中病原菌競(jìng)爭(zhēng)可利用的鐵而抵抗病原菌，從而達(dá)到促進(jìn)植物的生長的作用[20]。由此可見，這3種內(nèi)生菌主要在棉花固氮、提供微量元素、抵抗病原菌方面起到一定的作用。綜合以上結(jié)果認(rèn)為，盡管棉花根系組織和根際土壤中微生物群落顯著不同，但是對(duì)于棉花的健康生長都起到很積極的作用，也為進(jìn)一步挖掘和開發(fā)新的植物生長促進(jìn)劑和病害防治資源提供依據(jù)。

4? 致謝

感謝新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)第一師農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所武剛同志對(duì)本研究的幫助！

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收稿日期：2020-5-13

基金項(xiàng)目：大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練項(xiàng)目（2019016）;塔里木大學(xué)校長基金博士項(xiàng)目（TDZKJC201801）。

通信作者：郝海婷，m18919046163@163.com。