張紅麗 尹國宇 鄭艷玲 高娟 高燈州 常永凱 劉程

摘要：以長江口潮灘作為研究區(qū)域，采用¹⁶N同位素示蹤技術(shù)，模擬研究了沉積物再懸浮過程對水體反硝化和厭氧氨氧化的影響，結(jié)果表明，沉積物再懸浮引起的上覆水體反硝化和厭氧氨氧化速率與水體濁度呈顯著的正相關(guān)關(guān)系，這說明沉積物再懸浮能夠促進(jìn)水體脫氮過程的發(fā)生，在沉積物再懸浮條件下，采樣點(diǎn)反硝化與厭氧氨氧化速率受不同站位理化因素的影響，存在明顯的空間差異，且主要受沉積物總有機(jī)碳含量的控制，此外，隨著沉積物再懸浮濁度的增加，水體中反硝化細(xì)菌nits基因與厭氧氨氧化細(xì)菌16SrRNA基因豐度均呈增加趨勢，這說明沉積物再懸浮可增加水體脫氮功能菌群的豐度，進(jìn)而增加脫氮速率，研究結(jié)果表明，評價河口潮灘沉積物再懸浮對氮轉(zhuǎn)化過程的影響具有重要的科學(xué)意義。

關(guān)鍵詞：再懸?。簼岫龋悍聪趸簠捬醢毖趸?/p>

中圖分類號：X55文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.3969/j，issn，1000-5641.201941007

0引言

隨著工農(nóng)業(yè)的發(fā)展，大量的活性氮通過河流、地下水以及大氣沉降等方式進(jìn)入河口濕地生態(tài)系統(tǒng)，導(dǎo)致河口水體富營養(yǎng)化和有害藻類赤潮頻繁暴發(fā)，反硝化和厭氧氨氧化作為氮循環(huán)關(guān)鍵過程，可以將水生生態(tài)系統(tǒng)中的生物有效性氮轉(zhuǎn)化為氮?dú)猓侨コ钚缘闹匾緩?，對河口生態(tài)環(huán)境具有重要的作用，目前，由于反硝化和厭氧氨氧化過程被認(rèn)為是在缺氧或厭氧環(huán)境中發(fā)生，河口濕地反硝化和厭氧氨氧化的研究主要集中在沉積物或沉積物一水界面，然而，上覆水體顆粒物也是反硝化和厭氧氨氧化過程發(fā)生的關(guān)鍵微界面，因此，研究河口濕地沉積物再懸浮對反硝化和厭氧氨氧化過程的影響對于深入認(rèn)識河口環(huán)境氮循環(huán)機(jī)理具有重要意義。

目前，大量研究發(fā)現(xiàn)，可利用性氮、有機(jī)質(zhì)、硫化物、溫度、鹽度和溶解氧等是影響河口潮灘脫氮過程的主要因素，近年來，有研究表明水動力引起的沉積物再懸浮會影響氮形態(tài)及循環(huán)過程，如Liu等的研究發(fā)現(xiàn)，在含氧水體的懸浮泥沙上存在反硝化過程，其速率隨著懸浮泥沙濃度的增加而增大，然而，以往沉積物再懸浮對氮循環(huán)影響的研究主要集中在河流，對河口潮灘濕地沉積物再懸浮作用下脫氮過程變化的認(rèn)識還鮮見報道，河口潮灘濕地作為海陸相互作用的過渡地帶，潮流和波浪水動力強(qiáng)烈，沉積物再懸浮過程明顯因此，開展沉積物再懸浮對河口潮灘上覆水體脫氮過程的影響研究具有重要的科學(xué)價值和環(huán)境意義。

基于此，選取地處我國工業(yè)化程度高、人口最為密集，并且由于潮汐作用的頂托，大量的泥沙在該地區(qū)停滯、沉積的長江口潮灘濕地作為研究區(qū)域，通過野外采樣及室內(nèi)模擬實驗，開展沉積物再懸浮對反硝化和厭氧氨氧化的影響，并探討沉積物環(huán)境因素對反硝化與厭氧氨氧化的影響特征，以期為深入認(rèn)識河口氮循環(huán)過程和氮污染控制提供重要的理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1樣品采集

沿著長江口，選取滸浦（xP）、瀏河口（LHK）、石洞口（sDK）、白龍港（BLG）、東海農(nóng)場（DHNC）以及蘆潮港（LCG）6個站位（見圖1），于2017年10月，采集每個站位沉積物和上覆水，采用有機(jī)玻璃柱（直徑24cm，高40cm）采集原位柱狀沉積物，采水瓶采集5L原位水，樣品采集完后立即帶回實驗室，一部分保存于4℃，用于理化性質(zhì)分析;一部分沉積物裝入培養(yǎng)裝置中，加入原位水進(jìn)行培養(yǎng)實驗;另一部分保存于-80℃，用于進(jìn)行分子生物學(xué)實驗，

1.2理化性質(zhì)分析

采用YSI 30型鹽度計和Merrier-Toledo pH計分別測定沉積物（水土質(zhì)量比為2.5：1）的鹽度和pH利用烘干法測定土壤含水量，沉積物粒度使用LSl3320激光粒度分析儀（Backmanconlter，USA）分析，采用鄰菲羅啉比色法測定活性鐵，首先以1mol-L^-1HCI萃取，F(xiàn)e（Ⅱ）直接加顯色劑顯色測定，F(xiàn)e（Ⅲ）加適量鹽酸羥胺將Fe（Ⅲ）還原為Fe（Ⅱ）再進(jìn)行測定，采用碳氮元素分析儀（VarioELⅢ）分析沉積物有機(jī)碳（Total organic carbon，TOC），采用硫化銀電極（Thermo Scientific Orion）測定沉積物硫化物，檢測限為0.09ILmol-L^-1，使用2mol-L^-1的KC1萃取上覆水中NO3^-、NO2^-和NH4⁺，然后使用連續(xù)流動分析儀（sKALAR SAN++，Netherlands）測定，每項理化參數(shù)進(jìn)行3個平行分析，

1.3連續(xù)流培養(yǎng)實驗

培養(yǎng)實驗采用自行設(shè)計的模擬再懸浮系統(tǒng)實驗裝置（見圖2），該裝置可通過調(diào)節(jié)螺旋槳轉(zhuǎn)速，模擬不同沉積物再懸浮引起的不同濁度，裝置罐身為有機(jī)玻璃柱，外徑240mm，壁厚5mm，高400mm，上部與磁力攪拌機(jī)通過密封環(huán)連接;下部是塑料擋板與密封環(huán)鑲嵌式底座，在密封環(huán)上留有進(jìn)樣孔、出樣孔以及傳感器探頭孔，通過濁度傳感器與溫度傳感器可實時監(jiān)控裝置內(nèi)的濁度與溫度情況，連續(xù)進(jìn)出水可保證培養(yǎng)罐內(nèi)一直處于有氧環(huán)境，最大程度上模擬野外環(huán)境，實驗前使用真空泵抽氣，檢測裝置氣密性，使裝置內(nèi)部壓強(qiáng)降到0.9個壓強(qiáng)，并且可以保持24h。

將采集的原位柱狀沉積物樣品置于實驗裝置中，裝置氣密性檢查合格后，通過蠕動泵輸入添加15N03濃度達(dá)到100umol·L^-1的原位水樣，穩(wěn)定24h后，啟動攪拌裝置，將懸浮泥沙濁度按照潮灘上覆水在潮周期內(nèi)濁度的變化范圍分為100NTU，200NTU，300NTU，400NTU及不懸?。∣ NTU）（NephelometricTurbidity Unit散射濁度）5種情況，對應(yīng)懸浮顆粒物濃度在0-10g·L^-1之間，分別進(jìn)行培養(yǎng)，再穩(wěn)定24h后使得沉積物與水之間達(dá)到穩(wěn)定交換狀態(tài)，24h后，每3h用12.5mL的玻璃氣密小瓶（12.5mLExetainer，Labco，High Wycombe，UK）采集一次入水口和出水口的水樣，每天5次，用于反硝化、厭氧氨氧化速率的測定，結(jié)果取平均值，樣本收集后，在每個樣品中注射200ul50%ZnCl2抑制微生物活性，此外，選取SDK站位樣品，在沉積物連續(xù)流培養(yǎng)期間，每3h取一次水樣，每天5次，用于DNA的提取以及定量PCR分析，結(jié)果取平均值，培養(yǎng)期間培養(yǎng)室室溫始終控制在20℃左右，實驗期間對溶氧進(jìn)行了實時監(jiān)控，溶氧范圍為8.01～9.08mg·L^-1。

1.4反硝化與厭氧氨氧化速率的計算

1.6統(tǒng)計分析

采用SPSS 22.0軟件（sPSS Inc，USA）進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，利用單因素方差分析反硝化和厭氧氨氧化的空間差異，使用Pearson進(jìn)行相關(guān)分析，圖采用Origin 8.0軟件繪制，

2結(jié)果

2.1沉積物理化性質(zhì)及微生物組成

采樣點(diǎn)沉積物理化性質(zhì)如表1所示，沉積物鹽度為0.1～0.8psu，其中LCG和DHNC站位高于其他站位，pH值為7.58～8.17.最高值出現(xiàn)在BLG站位，沉積物主要由黏土（4%）和粉砂土（94%）組成，砂含量較低（2%），平均粒徑為12.21～22.96um，其中SDK的平均粒徑最大，沉積物中鐵氧化物含量為0.15～0.36mg·g-1，，次鐵氧化物含量為0.29～0.43mg，g-1.沉積物有機(jī)碳和硫化物的濃度分別為4.79～11.97mg·g-1和0.06～3.00ug·g-1.均在SDK站位最高，且SDK硫化物濃度遠(yuǎn)高于其他站位，沉積物中NO3-濃度范圍為110.77～290.38umol·g-1而與NO3-含量相比，區(qū)內(nèi)NH4+含量和NO2-含量較低，分別為0.03～1.58umol·g-1和0.06～0.14umol·g-1反硝化nits基因豐度在7.16×10⁶-9.28×107+之間，其中，SDK的基因豐度最大，厭氧氨氧化16S rRNA基因豐度在4.13×105～8.33×10s之間，16S rRNA基因豐度的最大值也是在SDK站位，

2.2沉積物再懸浮對脫氮過程的影響

沉積物反硝化速率為35.59～3492.08mg N，m^-2d-1.且隨著濁度增加而增加，具有良好的線性關(guān)系（見圖3），以SDK為例，其速率與濁度的線性表達(dá)式為y=7.98x+469.77.R²=0.852.其中，SDK站位的反硝化速率增長量最大，為3492.08mg N，m^-2.d-1;DHNC次之，為2470.57mg N，m^-2.d-1;BLG站位的反硝化速率增長量最小，為326.46mg N·m^-2·d-1.SDK和DHNC站位的反硝化速率對沉積物再懸浮濁度響應(yīng)較為敏感，其反硝化速率顯著增加（one-way ANOVA，F(xiàn)=4.7787.df=29.p<0.01），除了0和100NTU，在同一濁度下，SDK和DHNC站位的反硝化速率高于其他站位，

不同濁度下沉積物再懸浮對厭氧氨氧化速率如圖4所示，隨著濁度的變化，厭氧氨氧化速率變化為1.65～143.54mg N·m^-2.d-1.與反硝化速率對再懸浮的響應(yīng)相似，不同站位厭氧氨氧化速率總體上也均隨著濁度增加而增加，且具有良好的線性關(guān)系，以LCG為例，其速率與濁度的線性表達(dá)式為y=0.219x+14.134.R²=0.828.其中，SDK站位的厭氧氨氧化速率增長量最大，為126.22mg N·m^-2·d-1;BLG站位的厭氧氨氧化速率增長量最小，為35.12mg N·m^-2·d-1.SDK、LCG、LHK和XP站位的厭氧氨氧化速率對沉積物再懸浮濁度響應(yīng)較為敏感，其厭氧氨氧化速率顯著增加（one-way ANOVA，F(xiàn)=13.1710.df=29.p<0.05），在同一濁度下，BLG和DHNC站位的厭氧氨氧化速率低于其他站位，

經(jīng)冗余分析（RDA分析），明確了反硝化、厭氧氨氧化過程在不懸浮和再懸浮狀態(tài)下與環(huán)境因子之間的關(guān)系（見圖5），兩個主坐標(biāo)對所有樣點(diǎn)反硝化和厭氧氨氧化速率的解釋貢獻(xiàn)均為100%，在不懸浮狀態(tài)下，反硝化速率和厭氧氨氧化速率與硫化物、平均粒徑、TOC、NO2^-、Fe3+呈正相關(guān)，其中反硝化速率與硫化物顯著相關(guān)（p<0.01），占RDA總解釋量的85%，而在再懸浮狀態(tài)下，反硝化速率和厭氧氨氧化速率與TOC、平均粒徑、N02、Fd³⁺、鹽度、硫化物呈正相關(guān)，其中反硝化速率與TOC濃度顯著相關(guān)（p<0.05），占RDA總解釋量的81%，結(jié)果中，其他環(huán)境因子的貢獻(xiàn)均不顯著（p>0.05），

再懸浮狀態(tài)下，反硝化過程的脫氮貢獻(xiàn)率占到81%～99%，而厭氧氨氧化過程的脫氮貢獻(xiàn)率僅占1%-19%（見圖6），這說明在長江口潮灘再懸浮狀態(tài)下，反硝化過程是主要的脫氮過程，而且，在不同站位，濁度與反硝化和厭氧氨氧化占整體脫氮的比例沒有明顯相關(guān)關(guān)系（p>0.05）。

2.3反硝化細(xì)菌（nits基因）和厭氧氨氧化細(xì)菌（16s rRNA基因）豐度

SDK站位不同濁度反硝化nits和厭氧氨氧化16S rRNA基因豐度見圖7.nits基因豐度為1.04×104+～2.68×105+ copies-L-1.與懸浮濁度呈顯著正相關(guān)（p<0.05），16S rRNA基因豐度為1.31×103+-1.93×104copies，L=1.與反硝化細(xì)菌nits基因變化特征相似，厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因豐度隨著懸浮濁度增加而增加（p<0.01），反硝化和厭氧氨氧化速率與反硝化細(xì)菌nits和厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因豐度相關(guān)分析顯示（見圖8），反硝化細(xì)菌nits基因豐度與反硝化速率呈極顯著正相關(guān)（R=0.838.p<0.01），厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因豐度與厭氧氨氧化速率呈顯著正相關(guān)（R=0.763.p<0.01）。

3討論

長江口處于高氮負(fù)荷的河口生態(tài)區(qū)，又受到潮汐、徑流、波浪和風(fēng)暴潮等動力因子的影響造成沉積物再懸浮，從而引起生源要素在沉積物和水體的再分配，進(jìn)而影響氮素的生物地球化學(xué)循環(huán)，因此，研究沉積物再懸浮對反硝化和厭氧氨氧化過程的影響對改善長江口生態(tài)環(huán)境具有重要的環(huán)境意義，以往的研究主要基于沉積物研究脫氮過程，對發(fā)生再懸浮的上覆水體中的脫氮過程缺乏足夠的認(rèn)識，本研究采用再懸浮模擬實驗，得出長江口濕地沉積物再懸浮對上覆水體的反硝化和厭氧氨氧化過程具有顯著的影響，其脫氮速率隨著再懸浮沉積物濁度的增加而增加，再懸浮狀態(tài)下，不同站位反硝化速率對沉積物再懸浮濁度響應(yīng)存在明顯差異，且主要受總有機(jī)碳的影響，nirS和16S rRNA基因豐度隨著懸浮泥沙濁度的增加也都呈增加的趨勢。

本研究中反硝化和厭氧氨氧化速率隨著再懸浮濁度的增大而增大，與淡水生態(tài)系統(tǒng)的研究結(jié)果相一致，一般認(rèn)為，再懸浮引起的氧溶解能促進(jìn)硝化作用的發(fā)生，進(jìn)而促使硝酸根的生成速率加快，為反硝化和厭氧氨氧化過程提供反應(yīng)基質(zhì);發(fā)生再懸浮時水體的流動以及懸浮泥沙周圍存在大量的厭氧微空間，為反硝化和厭氧氨氧化過程提供反應(yīng)場所1.反硝化過程是主要的脫氮過程，與此前長江口及近岸水域研究結(jié)果相同，反硝化是長江口邊灘最重要的活性氮削減過程，反硝化貢獻(xiàn)率在85%左右，厭氧氨氧化貢獻(xiàn)率在15%左右，而且，在不同站位，濁度對于反硝化和厭氧氨氧化占整體脫氮的比例沒有顯著影響，這可能是由于濁度對反硝化和厭氧氨氧化速率的影響程度較為接近，此前有研究表明，長江口沉積物中由于反硝化菌可以為厭氧氨氧化菌提供主要的亞硝氮來源，厭氧氨氧化速率與反硝化速率存在顯著正相關(guān)關(guān)系，所以，在再懸浮狀態(tài)下可能也存在這種機(jī)制，造成二者變化程度差別不大。

不同站位在再懸浮條件下，反硝化速率和厭氧氨氧化速率對沉積物再懸浮濁度響應(yīng)不同，這可能與再懸浮條件下的背景理化性質(zhì)有關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)，再懸浮可以改變理化性質(zhì)對于反硝化和厭氧氨氧化速率的影響情況，此外，本研究發(fā)現(xiàn)，DHNC和SDK站位的反硝化速率高于其他站位，沉積物理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，SDK和DHNC站位沉積物TOC含量總體上高于其他站位，在高濁度下，SDK和DHNC站點(diǎn)再懸浮沉積物有機(jī)碳和反硝化細(xì)菌數(shù)量可能會急劇增加，進(jìn)而導(dǎo)致反硝化速率顯著提高，一般而言，反硝化速率與可利用性碳氮基質(zhì)密切相關(guān)，其中有機(jī)碳為反硝化過程提供必要電子，—定濃度下，有機(jī)質(zhì)的增加會促進(jìn)反硝化過程，同時有機(jī)碳還會影響微生物的生長，進(jìn)而對反硝化過程產(chǎn)生刺激作用，調(diào)查發(fā)現(xiàn)，SDK站點(diǎn)位于上海市最大的污水處理場附近，含有大量有機(jī)物質(zhì)的污水排放增加了該站點(diǎn)沉積物有機(jī)碳含量，而廢水排放，有機(jī)物質(zhì)分解消耗氧氣，形成一個相對厭氧的環(huán)境，這有利于厭氧微生物細(xì)菌的生長，而DHNC由大量蘆葦、互花米草和海三棱蔗草等植被覆蓋，尤其是蘆葦和互花米草具有較高的初級生產(chǎn)力和固碳能力，這可為該站點(diǎn)提供一定數(shù)量和質(zhì)量的有機(jī)質(zhì)，在各采樣點(diǎn)中，SDK的硫化物含量最高，硫氧化細(xì)菌在代謝過程中會以硝酸鹽作為電子受體，進(jìn)而促進(jìn)反硝化的進(jìn)行l(wèi)引，此外，厭氧氨氧化對濁度響應(yīng)的研究結(jié)果表明，SDK、LCG、LHK和XP的厭氧氨氧化速率對濁度的響應(yīng)較BLG和DHNC更為明顯，且在同一濁度下，BLG和DHNC厭氧氨氧化速率總體上也低于其他站點(diǎn)，產(chǎn)生這一現(xiàn)象可能與鹽度和NH4+等理化性質(zhì)有關(guān)，有研究表明，高鹽度會在一定程度上抑制厭氧氨氧化速率，基于這一理論，LCG和DHNC會有較低的厭氧氨氧化速率，然而LCG并沒有呈現(xiàn)這一特征，這可能主要是因為LCG具有較高的NH4+含量，在再懸浮條件下為厭氧氨氧化過程提供機(jī)制，進(jìn)而促進(jìn)了其厭氧氨氧化速率，此外，LCG沉積物的平均粒徑顯著小于其他采樣點(diǎn)，有研究指出，粒徑越小，比表面積越大，厭氧氨氧化細(xì)菌數(shù)量越多，與NO3-接觸的范圍越廣，這也會促進(jìn)厭氧氨氧化速率。

為了進(jìn)一步探究河口濕地沉積物再懸浮對脫氮過程的微生物驅(qū)動機(jī)制，我們選取了SDK站位，研究了濁度與反硝化細(xì)菌nits和厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因豐度的關(guān)系，nits和16S rRNA基因豐度均隨著懸浮泥沙濁度的增加呈增加的趨勢，主要原因可能是在上覆水體中，細(xì)菌主要附著在懸浮顆粒物上，因此，增大再懸浮沉積物的濁度，基因的豐度就會隨之增加，在懸浮顆粒物表面存在大量的厭氧微空間，為反硝化和厭氧氨氧化細(xì)菌提供了適宜的環(huán)境，進(jìn)而增加了反硝化和厭氧氨氧化菌群的活性，此外，本研究相關(guān)性分析結(jié)果表明，nits和16S rRNA基因豐度分別與反硝化和厭氧氨氧化速率呈顯著正相關(guān)，李佳霖等也發(fā)現(xiàn)，在長江口海域夏季沉積物中反硝化細(xì)菌豐度與反硝化速率呈顯著相關(guān)，這說明反硝化細(xì)菌和厭氧氨氧化菌的數(shù)量分別是影響反硝化和厭氧氨氧化速率的主要原因之一，這些研究結(jié)果表明，在河口濕地生態(tài)系統(tǒng)中通過劇烈的再懸浮過程，增加了功能微生物豐度，進(jìn)而促進(jìn)相關(guān)過程的速率，然而，本研究僅對再懸浮引起的微生物基因豐度變化與速率的關(guān)系進(jìn)行了探討，之后可以通過測序等手段進(jìn)一步分析菌群組成和結(jié)構(gòu)的變化，以便更好地理解再懸浮對脫氮過程的影響機(jī)制。

根據(jù)本研究模擬得出的平均反硝化速率和厭氧氨氧化速率，假設(shè)發(fā)生再懸浮的邊灘平均水深為1m，估計反硝化速率為630.72kg·km^-2.a-1.厭氧氨氧化速率為25.89kg·km^-2.a-1.這也說明了由再懸浮引起的脫氮過程對河口生態(tài)系統(tǒng)氮循環(huán)過程產(chǎn)生了重要的影響，然而，由于研究區(qū)環(huán)境因素和脫氮過程具有較大的時空差異，所估算的結(jié)果具有一定的不確定性，此外，室內(nèi)控制實驗可能會高估野外環(huán)境的速率，因此，后續(xù)的研究還應(yīng)加強(qiáng)野外實驗的研究，從而得出更加可靠的實驗結(jié)果，

4結(jié)論

（1）沉積物再懸浮對反硝化和厭氧氨氧化速率具有重要的影響，速率隨著再懸浮沉積物濁度的增加而增大。

（2）在再懸浮條件下，懸浮水體反硝化和厭氧氨氧化受不同站位背景理化因素影響，其中，TOC含量是影響的主要因素。

（3）反硝化細(xì)菌nits和厭氧氨氧化細(xì)菌16S rRNA基因豐度均隨著沉積物懸浮濁度的增加而顯著增加。