高曉琳，修霞，邱萍萍，張杜合一，謝舒樂，林釗宇

頭頸鱗癌（head and neck squamous cell carci?noma，HNSC）位于全球最常見惡性腫瘤的第八位，每年新發(fā)病例超過55萬［1］。HNSC具有局部復(fù)發(fā)率高，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點，臨床治療多采用以手術(shù)為主，輔以放化療或免疫療法，然而頭頸鱗癌患者的5年生存率仍低于50%［2，3］。FOS樣抗原1（FOS?like antigen 1，F(xiàn)OSL1）是FOS家族蛋白的成員，F(xiàn)OSL1和JunB家族蛋白形成異質(zhì)二聚體，共同組成腫瘤內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子——活化蛋白?1（activator protein?1，AP?1）［4］。目前研究證實FOSL1具有多種功能，如沉默F(xiàn)OSL1抑制了骨肉瘤細胞的增殖、遷移和侵襲；FOSL1抑制了Ⅰ型干擾素對瘧疾和病毒感染的反應(yīng)［5，6］。然而，關(guān)于FOSL1蛋白在頭頸鱗癌中的表達及其作用的報道尚未發(fā)現(xiàn)。本研究通過查詢數(shù)據(jù)庫及免疫組化等方法檢測FOSL1在頭頸鱗癌患者的表達水平，并分析其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集中山大學(xué)孫逸仙紀念醫(yī)院口腔頜面外科2010年3月至2014年8月根治性手術(shù)切除的頭頸鱗癌及其癌旁組織共98例。所有頭頸鱗癌患者術(shù)前均未接受放療或化療等治療。所有標本用4%多聚甲醛固定和石蠟包埋后制備4μm切片。所有患者均已被告知并簽署由本院倫理委員會批準的知情同意書。

1.2 UALCAN數(shù)據(jù)庫分析

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫（http：//ualcan.path.uab.edu/index.html/）獲取FOSL1基因在頭頸鱗癌內(nèi)的表達及預(yù)后情況，通過Expression選項中sample type、tumor grade、gender等分類預(yù)測FOSL1在HNSC中的表達情況；通過Survival模式，以中位數(shù)為cut?off，預(yù)測FOSL1表達與HNSC患者的生存曲線圖。

1.3 免疫組化

二甲苯及梯度酒精常規(guī)脫蠟，pH6.0枸櫞酸微波修復(fù)20 min，自然冷卻至室溫。3%H2O2避光孵育15 min，滴加FOSL1一抗（Santa Cruz公司，sc?28310，1∶500）4℃孵育過夜，PBS漂洗后滴加抗鼠IgG二抗（基因科技公司，GK500710）37℃孵育30 min，PBS漂洗后滴加DAB顯色劑，蘇木素染核，脫水后樹膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果FOSL1的表達情況。

1.4 免疫組化結(jié)果評判

FOSL1的表達主要位于細胞核內(nèi)，在高倍鏡下隨機選取5個視野，計算陽性細胞的百分比：0分是陽性細胞數(shù)＜5%，1分是陽性表達細胞數(shù)5%～24%，2分是陽性表達細胞數(shù)為25%～49%，3分是陽性表達細胞數(shù)為50%～74%，4分是陽性表達細胞數(shù)≥75%；同時評判染色深度：0分是不著色，1分是淡黃色，2分是棕黃色，3分是棕褐色。最后兩項得分相乘，0～3分的標本判定為低表達，4～12分的標本判斷為高表達。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，分析FOSL1蛋白表達與患者臨床病理指標之間的關(guān)系采用卡方檢驗。采用Kaplan?Meier法進行生存分析，繪制生存曲線。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 UALCAN數(shù)據(jù)庫獲取FOSL1在頭頸鱗癌中的表達

通過UALCAN數(shù)據(jù)庫，我們基于sample type、tumor grade、HPV status和nodal metastasis status等分類對比了FOSL1在HNSC組織的表達。我們發(fā)現(xiàn)FOSL1在頭頸鱗癌中的表達顯著高于癌旁組織（P=0.039）（圖1A）。其次，不同病理分級HNSC中FOSL1的表達均比癌旁組織高，其中Grade 2（intermediate grade）和Grade 4（high grade）HNSC中FOSL1顯著升高（P＜0.001）。不同病理分級HNSC組織內(nèi)FOSL1的表達呈顯著差異：Grade 1?vs?Grade 2（P=0.032），Grade 1?vs?Grade 4（P＜0.0001），Grade 2?vs?Grade 3（P=0.0106），Grade 2?vs?Grade 4（P＜0.0001），Grade 3?vs?Grade 4（P＜0.0001）（圖 1B）。HPV陽性HNSC患者（p16&ISH檢測）中FOSL1的表達顯著低于HPV陰性患者（P＜0.001）（圖1C）。此外，數(shù)據(jù)顯示與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者（N0）相比，僅有N3組HNSC患者（＞10個淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）中FOSL1表達顯著升高（P=0.0017），而N1組較N3組亦顯著升高（P=0.0012）（圖1D）。

2.2 免疫組化檢測FOSL1蛋白在頭頸鱗癌標本中的表達

我們發(fā)現(xiàn)FOSL1蛋白主要定位于細胞核內(nèi)。FOSL1在癌旁組織內(nèi)的陽性率僅為8.1%（8/98），且FOSL1表達呈弱陽性，而大部分癌旁組織FOSL1表達為陰性。然而FOSL1在頭頸鱗癌樣本中均有表達，其中54例（55.1%）頭頸鱗癌FOSL1呈高表達（強陽性），44例（44.9%）頭頸鱗癌FOSL1呈低表達（弱陽性）（圖2A～D）。

圖1 UALCAN數(shù)據(jù)庫檢測FOSL1蛋白在HNSC中的表達

圖2 頭頸鱗癌及癌旁組織內(nèi)FOSL1的表達（免疫組化，×200）

2.3 FOSL1的表達與頭頸鱗癌患者臨床病理指標的關(guān)系

FOSL1表達與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理分化程度顯著相關(guān)（P＜0.05），即高表達FOSL1的頭頸鱗癌患者的腫瘤直徑更大、分化程度更差、臨床分級更高，易發(fā)生區(qū)域性淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。而FOSL1表達水平與患者性別、年齡、遠處轉(zhuǎn)移等指標無明顯相關(guān)性（P＞0.05），結(jié)果見表1。

2.4 FOSL1 的表達對頭頸鱗癌患者預(yù)后的影響

UALCAN數(shù)據(jù)庫顯示高表達FOSL1的HNSC患者較低表達HNSC預(yù)后差，兩組之間具有顯著差異（P=0.035）（圖3A）。此外，我們通過Kaplan?Meier法分析FOSL1表達對98例HNSC患者（本院收集）預(yù)后的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中FOSL1低表達組的頭頸鱗癌患者中位生存時間為96個月，F(xiàn)OSL1高表達組的頭頸鱗癌患者中位生存時間為42個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

3 討論

目前AP?1蛋白被認為調(diào)控腫瘤、哮喘和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，它會響應(yīng)細胞因子、激素和生長因子等各種外界刺激，調(diào)控下游基因的表達繼而影響細胞的增殖、分化、凋亡等生物學(xué)過程［7，8］。AP?1是一種由Jun家族蛋白和Fos家族蛋白形成的高度保守的同源或者異源二聚體復(fù)合物，其中FOSL1屬于FOS蛋白家族的一員，它與Jun家族蛋白形成異源二聚體是眾多AP?1 復(fù)合物中最為穩(wěn)定的［8，9］。研究表明，AP?1主要通過FOSL1調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶家族降解細胞外基質(zhì)，進而腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲［7，8］。例如，在人結(jié)直腸癌細胞HT?29中AP?1結(jié)合在MMP7的DNA啟動子區(qū)，促進腸癌的轉(zhuǎn)移和侵襲［10］。此外，F(xiàn)OSL1的調(diào)控作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄和翻譯后修飾的水平，而蛋白水平的磷酸化是FOSL1調(diào)控翻譯后修飾的主要方式［8-10］。FOSL1主要由絲裂原活化蛋白激酶信號途徑調(diào)控，并被泛素非依賴性蛋白酶體降解［11］。此外，F(xiàn)OSL1可影響腫瘤的增殖、分化、侵襲和凋亡等生物學(xué)功能［4-6，11，12］。研究表明，F(xiàn)OSL1在乳腺癌、肺癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、鼻咽癌等腫瘤中過表達，而在宮頸癌和卵巢癌中的表達降低，在頭頸鱗癌中的表達仍存在爭議［11?14］。

表1 FOSL1蛋白表達與頭頸鱗癌臨床病理特征的相關(guān)性（n）

圖3 FOSL1的表達與頭頸鱗癌患者的預(yù)后

目前生物大數(shù)據(jù)庫在細胞生物學(xué)的研究中發(fā)揮了舉足輕重的作用，UALCAN整合了TCGA和MET500來源的數(shù)據(jù)，用于比較某一基因在特定腫瘤和正常組織、不同病理分類的腫瘤之間和不同類型正常組織內(nèi)的表達情況，同時還可以基因間的共表達分析、藥物敏感性基因篩查等［15］。本實驗中我們發(fā)現(xiàn)FOSL1在頭頸鱗癌中顯著高表達，且FOSL1高表達與HNSC患者預(yù)后差顯著相關(guān)（P＜0.05）。此外，F(xiàn)OSL1的表達與HNSC患者的病理分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和HPV狀態(tài)密切相關(guān)（P＜0.05）。

隨后我們通過免疫組化驗證FOSL1蛋白在頭頸鱗癌及癌旁組織中的表達情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)FOSL1在絕大多數(shù)頭頸鱗癌中均有表達，且頭頸鱗癌組織中FOSL1的表達顯著高于癌旁組織。通過卡方檢驗分析，我們發(fā)現(xiàn)FOSL1的表達與腫瘤的大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、HPV狀態(tài)及病理分化程度顯著相關(guān)（P＜0.05）。Kaplan?Meier分析表明高表達FOSL1的頭頸鱗癌患者生存率明顯低于低表達FOSL1的頭頸鱗癌患者。以上結(jié)果與數(shù)據(jù)庫預(yù)測的結(jié)果基本一致。本研究顯示FOSL1蛋白在頭頸鱗癌中顯著上調(diào)，且與頭頸鱗患者臨床特征及預(yù)后密切相關(guān)，提示FOSL1可能在頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到重要作用，它可以作為評估頭頸鱗癌患者預(yù)后的指標。